65細菌室工作流程

細菌室工作流程

檢驗醫(yī)師按照標(biāo)本采取規(guī)定進行標(biāo)本采取采取的標(biāo)本立即送往檢驗科微生物檢驗實驗室準(zhǔn)備檢驗對檢驗標(biāo)本進行檢查排序培養(yǎng)基配制及無菌試驗檢測培養(yǎng)基通過性能測試采取標(biāo)本接種細菌分型鑒定特殊菌種保存特殊菌種上報專業(yè)主管標(biāo)本按照規(guī)定儲存上報檢驗科主任專業(yè)主管對檢驗結(jié)果審核檢驗醫(yī)師對檢驗結(jié)果登記將報告送至住院患者所在臨床科室對有疑問的檢驗結(jié)果，召開全科人員討論研究，得出共識結(jié)果，并將所有資料存檔急診患者檢驗報告由檢驗科電話向急救中心值班醫(yī)師報告1

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細菌室工作流程簡介一、標(biāo)本接種與涂片染色（一）標(biāo)本的接種：

⑴培養(yǎng)基選擇及接種方式：

標(biāo)本類型培養(yǎng)基組合接種方式

痰、咽拭子血平皿+中國藍平皿+流感嗜血桿菌平皿三區(qū)劃線法尿血平皿+中國藍平皿血：直、曲線法，中：三區(qū)劃線法

分泌物血平皿+中國藍平皿三區(qū)劃線法大便SS平皿+TCBS平皿三區(qū)劃線法輸液液體、腹水、普通肉湯管直接傾倒膽汁、胃液、膿液等

血、腦脊液、骨髓、血培養(yǎng)瓶用注射器注入胸水、關(guān)節(jié)液

培養(yǎng)類別選擇性培養(yǎng)基接種方式真菌沙氏培養(yǎng)基直接劃線淋球菌巧克力淋球菌培養(yǎng)基直接劃線結(jié)核桿菌羅氏結(jié)核菌培養(yǎng)管直接劃線L型細菌高滲肉湯培養(yǎng)管直接接種霍亂弧菌堿性蛋白胨培養(yǎng)管直接接種⑵血培養(yǎng)瓶選擇如下：

培養(yǎng)瓶瓶的顏色抽血量（ml）標(biāo)準(zhǔn)需氧培養(yǎng)瓶藍色510標(biāo)準(zhǔn)厭氧培養(yǎng)瓶紫紅色510中和抗生素需氧培養(yǎng)瓶綠色510中和抗生素厭氧培養(yǎng)瓶橙黃色510小兒血培養(yǎng)瓶淺黃色12結(jié)核桿菌血培養(yǎng)瓶黑色510（二）標(biāo)本涂片和染色1、看濕片（未染色片）：

⑴正常人體的下呼吸道是無菌的，上呼吸道有正常菌群棲居。下呼吸道標(biāo)本來源有多種：痰、支氣管肺灌洗吸出液、氣管抽出液或刷子、肺穿刺或活組織等。

痰標(biāo)本在接種前需涂片鏡檢，以確認留取的標(biāo)本是否有臨床意義。在低倍鏡下計數(shù)每低倍視野白細胞和上皮細胞的平均數(shù)目，按照以下標(biāo)準(zhǔn)判定標(biāo)本是否適合做培養(yǎng)：

白細胞上皮細胞是否適合A：＞25＜10是B：＞25＜25是C：＜10＞25否不合格的標(biāo)本應(yīng)電話告訴臨床科室重留標(biāo)本。⑶霍亂弧菌（投標(biāo)樣動力，運動似流星）2、革蘭氏染色：

⑴涂片革蘭氏染色找細菌：革蘭氏陽性菌：球菌（G+C）、桿菌少（G+b）革蘭氏陰性菌：桿菌（G-b）、球菌少（G-C）⑵涂片革蘭氏染色找真菌：找菌絲、孢子⑶菌群分析：大便標(biāo)本球、桿菌比例。

備注：加德納爾氏菌是細菌性陰道癥的主要致病菌之一，此癥有如下特點：

1)陰道排出物過多；2)陰道PH＞4.5；

3)陰道上皮細胞被G-小b覆蓋形成為線索或線球細胞；

4)KOH試驗陽性：陰道分泌物滴加10%KOH后，立即出現(xiàn)魚腥味和氨味；

3、抗酸染色：

查找抗酸桿菌。如結(jié)核桿菌、麻風(fēng)桿菌。4、墨汁染色：

查找新型隱球菌。特點：有莢膜，夾膜折光性強。5、看菌落形態(tài)：1.肉眼看：

血平皿上：有臍窩狀的可能是草綠色鏈球菌，微黃色可能是奈瑟氏菌，干燥的可能是真菌，乳白色的可能是葡萄球菌，濕潤的可能是腸球菌。中國藍上：微黃色可能是奈瑟氏菌，有選擇性地促進革蘭氏陰性菌生長，發(fā)酵型革蘭氏陰性桿菌因分解乳糖能力不同，在此平皿上的菌落顏色不同。

流感嗜血桿菌平皿上：微黃色可能是奈瑟氏菌，（三）轉(zhuǎn)種：

1.陽性血培養(yǎng)瓶：1）涂片革蘭氏染色：找到細菌→向臨床科室報告；未找到細菌→暫不報告，待轉(zhuǎn)種生長后再報；2）轉(zhuǎn)種：血平皿、中國藍平皿。

2.肉湯管：1）培養(yǎng)3天后仍然透明清亮：轉(zhuǎn)種血平皿一個；2）渾濁：轉(zhuǎn)種血平皿、中國藍平皿各一個。二、細菌鑒定（視標(biāo)本、科室而定）

（一）標(biāo)本培養(yǎng)的菌落計數(shù)及有意義菌落的篩選1、痰：

（1）菌落計數(shù)

1）只有第一區(qū)生長，計103/ml；

2）第一、二區(qū)生長，第三區(qū)不長，計105/ml；3）三個區(qū)均生長，計107/ml；（2）菌落篩選

1）＜103/ml：視科別而定，除ICU、CCU、急診科、老年科和呼吸科危重病號外，一般報告為：無致病菌生長；

2）＝103/ml：除非細菌生長較純或可能為葡萄球菌需進一步處理外一般報告為：無致病菌生長；

3）＞103/ml：①根據(jù)菌落形態(tài)將其中意義不大的標(biāo)本報告單發(fā)出，一般報告為：無致病菌生長；微黃色報告奈瑟氏菌；

血平皿上有臍窩狀可能為草綠色鏈球菌，需做如下鑒定：4）血平皿：草綠色鏈球菌做OPTOCHIN；中國藍：真菌（YBC）轉(zhuǎn)沙氏、種芽管。2、尿：

1）菌落計數(shù)：

定量接種環(huán)涂抹法：用10μl定量接種環(huán)取一環(huán)尿液在血平皿上做均勻劃線接種，置于35℃24h培養(yǎng)，計數(shù)生長的菌落數(shù)，再乘以100，即為每毫升菌落數(shù)。菌落生長過多不可計數(shù)時，報告＞105cfu/ml。

2）一般情況下細菌數(shù)不會超過103cfu/ml，診斷泌尿系感染的細菌學(xué)標(biāo)準(zhǔn)是：菌落計數(shù)≥105cfu/ml。3、前列腺液：

1）密集生長→分純（選乳白色的菌落）→鑒定2）偶有生長→報告為：無致病菌生長3）無菌生長→報告為：無細菌生長4、大便：

中國藍及SS平板：找細小、無色、透明的菌落→KIA試驗＋：血清學(xué)鑒定

－：報告無致病菌生長

TCBS平板：黃色菌落→氧化酶：+：O/F試驗：＋：上機藥敏－：報告無致病菌生長

－：很少，可能為梅氏弧菌，報告無致病菌生長

5、其他標(biāo)本（血、腦脊液、靜脈管等）的細菌鑒定：一般不需計數(shù)，只要有細菌生長（污染菌除外），就需進行鑒定處理。三、鑒別試驗：

1、血平板（鏈球菌屬）細小、圓形、表面光滑、灰白色、半透明（1）選血平皿上有臍窩狀的菌落（可能是草綠色鏈球菌）：在血平皿上做OPTOCHIN（奧卜托欣）試驗：1）＋：報告肺炎鏈球菌2）－：報告草綠色鏈球菌

（2）牛奶美藍試驗：1）＋：糞腸球菌2）－：手工生化反應(yīng)組鑒別菌類

（3）衛(wèi)星現(xiàn)象（用金黃色葡萄球菌做）：

1）血平皿：＋：流感或付流感→M-H平皿：＋：付流感：無致病菌生長

－：無致病菌生長－：流感2）細菌與生長因子：

血平皿上有V+X因子，（藥平皿）M-H平皿上有V因子。細菌名稱所需生長因子流感嗜血桿菌Ⅴ+Ⅹ付流感嗜血桿菌Ⅴ杜克氏菌Ⅹ2、涂片：

陽性桿菌→上機BAC卡陽性球菌→做觸酶（H2O2）陰性桿菌→做氧化酶（OX）

真菌（YBC）→轉(zhuǎn)沙氏（分純）、種芽管（看是不是白色念珠菌）可疑金黃色葡萄球菌要加做凝固酶加以確定

3、用KOH（氫氧化鉀）拉絲試驗（鑒別陰性菌還是陽性菌）拉絲＋：是陰性菌拉絲－：是陽性菌4、觸酶（H2O2）：

先挑取菌落1個，加1滴H2O2，馬上出現(xiàn)氣泡的為陽性，其次為陰性。在革蘭氏陽性菌中，鏈球菌觸酶試驗陰性，葡萄球菌、微球菌均陰性。5、凝固酶：

可疑為金黃色葡萄球菌做凝固酶：100ul血漿＋300ul生理鹽水＋1個菌落。

6、上機、藥敏：

G-b做氧化酶，G+C做觸酶（CAT）

革蘭氏陰性菌G-b要做氧化酶（試紙片法）。

中國藍上生長G-b的菌落（非真菌）：氧化酶＋：上機GNI反應(yīng)卡涂黑→●、革蘭氏陰性菌藥敏3板（①②③）

氧化酶－：上機GNI反應(yīng)卡→、革藍氏陰性菌藥敏4板（①②③④）

中國藍不生長G+C的白色菌落做觸酶：1）＋→凝固酶：

玻片法＋→試管法＋：報金黃色葡萄球菌、G＋藥敏＋葡萄球菌＋（OX）苯唑－：上機GPI○、G＋藥敏＋葡萄球菌＋（OX）苯唑西林－：上機GPI○、G＋藥敏＋鏈球菌

2）－：牛奶美藍1）＋：糞腸球菌、腸球菌藥敏2）－：手工生化反應(yīng)組鑒別菌類

7、種芽管（鑒定是否是白色念珠菌）同時轉(zhuǎn)沙氏：種芽管：300ul血清＋1個真菌菌落

1）＋：報告為白色念珠菌不用上機→直接做真菌藥敏；

2）－：上機YBC（真菌）卡室溫放置24h后放入檢測儀，如不能鑒定其種屬，需再室溫放置24h后放入檢測儀鑒定，如仍不能鑒定其種屬則需做手工生化鑒定→真菌藥敏。四、分純

平板上不純的菌落經(jīng)涂片

1）一般原則是血→血，中國蘭→中國蘭，沙氏→沙氏。2）革蘭氏陽性菌：轉(zhuǎn)血平板；3）革蘭氏陰性菌：轉(zhuǎn)中國蘭；4）真菌：轉(zhuǎn)沙氏培養(yǎng)基。五、上機藥敏

1、常用的幾種生化反應(yīng)卡

1）革蘭氏陰性菌：GNI反應(yīng)卡，將菌液充入卡中直接上機；2）革蘭氏陽性球菌：GPI反應(yīng)卡，將菌液充入卡中直接上機；3）革蘭氏陽性桿菌：BAC反應(yīng)卡，將菌液充入卡中直接上機；

4）真菌：YBC反應(yīng)卡，將菌液充入卡中于室溫放置24h后再上機讀卡。2、上機孔標(biāo)記：

1）革蘭氏陰性菌：GNI反應(yīng)卡，氧化酶陽性（○→●）2）革蘭氏陰性菌：GNI反應(yīng)卡，氧化酶陰性（○→○）3）革蘭氏陽性菌：GPI反應(yīng)卡，觸酶陽性（○→●）4）革蘭氏陽性菌：GPI反應(yīng)卡，觸酶陰性（○→○）5）BAC反應(yīng)卡：不需涂黑

6）YBC反應(yīng)卡：室溫放置24h，讀卡，（○→●）室溫放置48小時。3、藥敏

1）革蘭氏陰性菌：氧化酶：＋：1、2、3號革蘭氏陰性菌藥敏板－：1、2、3、4號革蘭氏陰性菌藥敏板

2）革蘭氏陽性球菌：觸酶：＋：1革蘭氏陽性菌藥敏板、葡萄球菌藥敏板及苯唑西林（OX）

－：1號革蘭氏陽性菌藥敏板、鏈球菌藥敏板

3）革蘭氏陽性桿菌：一般不做藥敏，如臨床醫(yī)生要求，則使用Etest法判讀最小抑菌濃度MIC。4）真菌：1、2號真菌藥敏板5）ESBL：

4、次日測量藥敏結(jié)果并在計算機細菌鑒定系統(tǒng)中查記鑒定出的前一天上機細菌的菌名，如非真菌類細菌未被鑒定出，則須人工查閱鑒定手冊，如仍不能查出，可進行手工生化鑒定或重新上機；如真菌類細菌未被鑒定出，則須將生化反應(yīng)卡再于室溫放置24h后上機讀卡即可獲得結(jié)果。六、報告結(jié)果

1）將中文菌名印于原始化驗單上；

2）對于痰標(biāo)本培養(yǎng)，將其濕片結(jié)果及菌落計數(shù)印于化驗單上；對于尿標(biāo)本培養(yǎng)，將其菌落計數(shù)印于化驗單上；

3）打印非真菌（革蘭氏陰性、陽性菌）藥敏單，貼于化驗單上；4）打印真菌藥敏單，貼于化驗單上；

5）超廣譜β內(nèi)酰胺酶（ESBL）陽性的要在報告單上注明；

6）將報告日期、報告者姓名印于化驗單，然后在登記本上記錄結(jié)果，最后向臨床科室發(fā)出報告單（包括化驗單和藥敏單）。七、其他項目（一）接種項目

1、淋球菌培養(yǎng)：35℃48h培養(yǎng)后，細小、透明似水滴狀，凸起、光滑、圓形、無色素菌落→氧化酶（1）＋：糖類分解試驗及有關(guān)試驗：葡萄糖（＋）麥牙糖、乳糖、蔗果糖、硝亞硝（）多糖體合成及DNA酶（－）（2）－：報告為無淋球菌生長，陽性的要加做紙片法藥敏。2、L型細菌：由串珠狀鏈桿菌變異而來，形態(tài)及染色性多變，最突出的特點是細胞壁缺失，確認通常靠觀察菌落形態(tài)和染色性。低倍鏡下：細胞壁缺失的細菌

⑴典型的L型：“油煎蛋”樣菌落，中心部位致密，透光度差，嵌入生長，周圍透明；

⑵不典型的G型：比L型菌落大，無透光度差的核心，整個菌落呈透明顆粒狀；

⑶不典型的F型：菌落有時可見致密核心，其周邊或全部由長絲構(gòu)成；⑷備注：L型細菌具“返祖”特性，利用此點可與支原體（不返祖）相鑒別，而且只有反祖后才能進行種別鑒定，其對作用于細胞壁的抗生素（如青霉素、頭孢霉素等）常有耐藥性，而能干擾細菌蛋白合成的抗生素（如卡那霉素、鏈霉素、慶大霉素等）對L型細菌的抑制作用較強。3、支原體培養(yǎng)專用肉湯管：1）紅色清亮透明：報告為有尿素支原體生長；

2）紅色渾濁：可能有其他細菌污染，報告為無支原體生長；3）培養(yǎng)3天后不變紅、保持原色，報告為無支原體生長；

4）藥敏有專用試劑盒：判斷藥敏結(jié)果的方法與判斷有無支原體生長的方法基本相同：顏色變紅的為耐藥，即生長；顏色不變的為敏感，即不長；藥物濃度高的不變色，濃度低的變紅為中介，即在高濃度的藥物中不生長，而在低濃度的藥物中可生長。4、空氣培養(yǎng)（計數(shù)）：

所有平板的菌落數(shù)之和÷平板數(shù)×157＝報告結(jié)果。（二）試劑盒項目（免疫法）原理：抗原抗體反應(yīng)，凝集反應(yīng)。

沙眼衣原體抗原（免疫法）肺炎支原體抗體（免疫法）肺炎衣原體抗體（免疫法）軍團菌抗體（免疫法）八、細菌培養(yǎng)基制備（一）平板基礎(chǔ)液

血平皿中國藍平皿藥敏平皿空氣平皿沙氏平皿SSTCBS（二）肉湯管

普通肉湯管高滲肉湯管堿性蛋白胨管支原體肉湯管（三）斜面羅瓊氏培養(yǎng)基（結(jié)核桿菌培養(yǎng)基）枸櫞酸鹽管雙糖管（四）生化反應(yīng)管糖類氨基酸類醇類其他

（五）倒好培養(yǎng)基后要做無菌試驗（六）儲存于冰箱冷藏備用。

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