獸醫(yī)(動醫(yī))藥理學(xué)教學(xué)實踐開題報告

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)

獸醫(yī)藥理學(xué)教學(xué)實踐開題報告

瓊脂擴(kuò)散紙法測定20種藥物對大腸桿菌的敏感性及MIC、MBC測定

專業(yè)：動物醫(yī)學(xué)班級:零八級六班指導(dǎo)教師：林居純（副教授）

二○一○年十二月

瓊脂擴(kuò)散紙法測定20種藥物對大腸桿菌的敏感性及MIC、MBC測定組員信息表（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動醫(yī)08級6班，625014）【實驗背景及意義】大腸桿菌是畜禽腸道內(nèi)的常見細(xì)菌，體弱和幼齡動物受氣溫變化或食物變換等因素的影響時，腸道內(nèi)的這些條件性病原菌便大量繁殖，引起腸道疾病。將采集的大腸桿菌在培養(yǎng)基上培養(yǎng)生長，再制備各種抗菌藥片進(jìn)行藥敏試驗。本試驗通過藥敏試驗來檢測這種病原菌對不同抗菌藥物的敏感性及最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC），以選擇出有效藥物用于預(yù)防和治療這類疾病，同時避免了濫用藥物而形成耐藥菌株。【實驗原理】用浸有藥物的藥敏紙片貼在接種有大腸桿菌的培養(yǎng)基內(nèi)，藥物會沿著瓊脂向周圍擴(kuò)散，藥物會影響大腸桿菌的生長繁殖，因此可抑制其生長的藥物可致紙片周圍出現(xiàn)一圈不生長細(xì)菌的區(qū)域，稱為抑菌圈，表示此藥物對大腸桿菌的生長繁殖具有抑制作用。通過測定抑菌圈的直徑大小可以判定藥物的抑菌強(qiáng)弱，抑菌圈直徑越大表示藥物抑菌作用就越強(qiáng)，抑菌圈直徑越小表示藥物抑菌作用就越弱，沒有抑菌圈表示該藥物沒有抑菌作用。將抗菌藥物梯度稀釋、制備成培養(yǎng)基，用瓊脂法和液體法測定MIC。將液體發(fā)中無細(xì)菌生長的各菌液接種于無抗生素的CDC瓊脂培養(yǎng)基上，可測定該藥物的MBC。【材料】1、藥品及細(xì)菌氨芐青霉素、紅霉素、氟苯尼考、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、土霉素、氟哌酸、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、左氟沙星、利福平、鏈霉素、磺胺異惡唑、磺胺脒、甲溴東莨菪堿、頭孢噻呋、甲硝唑共19種抗菌藥物；生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、MH營養(yǎng)肉湯、MH瓊脂培養(yǎng)基；大腸桿菌。2、器材藥敏紙片、試管、移液器、烘箱、培養(yǎng)皿（30個，5種／個，6組／種）、鑷子、打孔器、無菌操作臺、酒精燈、96孔藥敏實驗板（24個，第一次12個，第二次12個）、高壓鍋、接種環(huán)、恒溫培養(yǎng)箱、CDC厭氧瓊脂培養(yǎng)基【實驗方法及內(nèi)容】Ⅰ、藥物敏感性測定1、藥敏紙片的制備（1）藥敏紙片制備和烘干的圓片，每20片放入一個小廣口瓶中，取質(zhì)量好的濾紙，用打孔器打成直徑6mm15min）干熱滅菌（160℃，2h），或濕熱滅菌（121℃，，在60℃下烘干。（2）藥物稀釋根據(jù)藥物說明進(jìn)行藥物配比，如規(guī)格為100g裝的抗菌藥物，包裝說明兌水400斤，即用天平稱取藥物1g加入50ml蒸餾水置于滅菌平皿內(nèi)，充分溶解后吸取1ml，置于另一）個滅菌的容器中再加入39ml蒸餾水（50×40。（3）紙片浸泡、干燥取配好的藥物溶液放入盛有紙片的小瓶內(nèi)（藥物的多少一浸透紙片為宜），浸泡24h37℃的烘箱內(nèi)烘干，而后加蓋至4~8℃的后將多余的藥液倒掉，在無菌條件下晾干或在冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2、細(xì)菌的轉(zhuǎn)種、活化培養(yǎng)（1）用無菌拭子將細(xì)菌接種到MH培養(yǎng)基中（6個），保證細(xì)菌均勻的涂布在培養(yǎng)基中。注意無菌操作。（2）將培養(yǎng)基置于37℃的恒溫箱中培養(yǎng)24h。3、接種、貼藥敏紙片（1）將上一步活化培養(yǎng)成功的細(xì)菌接種于培養(yǎng)基中，用無菌的鑷子輕輕夾取藥敏紙片貼在平板表面，注意將紙片鋪平，與瓊脂充分接觸，已經(jīng)貼下機(jī)遇不可再揭起，紙片與紙片的距離應(yīng)不少于24mm,紙片中心距離邊緣不少于15mm，15min內(nèi)應(yīng)貼完所有紙片。（2）將培養(yǎng)基置于37℃的恒溫箱中，培養(yǎng)24h。4、結(jié)果判斷紙片法藥物敏感性判斷標(biāo)準(zhǔn)抑菌圈直徑（mm）敏感度20mm及以上極敏15~20mm高敏10~14mm中敏10mm以下低敏0mm不敏

Ⅱ、藥物MIC、MBC的測定1、細(xì)菌的轉(zhuǎn)種、活化培養(yǎng)將菌株接種于5mlCDC厭氧培養(yǎng)基中，常規(guī)厭氧培養(yǎng)48h。2、細(xì)菌接種將抗菌藥物梯度稀釋、制備成藥物濃度分別為1,0.5,0.25,0.0625μg／ml的CDC厭氧瓊脂培養(yǎng)基和CDC厭氧液體培養(yǎng)基，將細(xì)菌劃線接種于瓊脂培養(yǎng)基（注意無菌操作）并另取0.5ml菌液接種于液體培養(yǎng)基。37℃厭氧培養(yǎng)72h。3、將CDC厭氧液體培養(yǎng)基中無細(xì)菌生長的各菌液分別接種于無抗生素的CDC瓊脂培養(yǎng)基上，常規(guī)培養(yǎng)72h。4、結(jié)果判定瓊脂培養(yǎng)基上無細(xì)菌生長的最低藥物濃度為MIC，液體培養(yǎng)基中混濁者為有菌生長，澄清者為無菌生長，無菌生長的最低藥物濃度為其MIC。步驟3中無細(xì)菌生長的最低藥物濃度為其MBC�！居懻摗�1、評價抗菌藥物抗菌作用的方法有哪些？2、不同抗菌藥物的抗菌原理。3、確保本實驗成功的關(guān)鍵？有哪些地方需要改進(jìn)？

擴(kuò)展閱讀：獸醫(yī)藥理學(xué)教學(xué)實踐結(jié)題報告——紙片擴(kuò)散法測定大腸桿菌對6種抗生素的敏感性

獸醫(yī)藥理學(xué)實踐教學(xué)結(jié)題報告

紙片擴(kuò)散法測定大腸桿菌對6種抗生素的敏感性

專業(yè)班級：指導(dǎo)老師：完成時間：實踐地點(diǎn)：

大腸桿菌對6種抗生素的敏感性檢測

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)

201*級1班）

摘要：大腸桿菌病(Colibacillosis)是由致病性大腸桿菌引起的消化道傳染病，流行廣，發(fā)病率和死亡率較高。這種病原菌主要經(jīng)動物的消化道而感染。能夠引起多種畜禽發(fā)生急性、慢性或隱性感染。藥敏試驗，是指對敏感性不能預(yù)測的分離菌株進(jìn)行試驗，測試抗菌藥在體外對病原微生物有無抑制作用，以指導(dǎo)選擇治療藥物和了解區(qū)域內(nèi)常見病原菌耐藥性變遷，有助于經(jīng)驗性治療選藥。通過此試驗可以幫助我們學(xué)習(xí)了解細(xì)菌對藥物的敏感試驗的常用方法，并根據(jù)這一原理,測定抗菌藥物的質(zhì)量,防偽劣假冒產(chǎn)品和過期失效藥物。以防盲目地濫用抗菌藥物,造成藥物的浪費(fèi),同時也貽誤了治療時機(jī)，會給養(yǎng)殖戶造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。

關(guān)鍵詞：大腸桿菌抗生素敏感性

前言：致病性大腸桿菌是引起動物感染最常見的病原微生物，它可引起畜禽發(fā)生嚴(yán)重腹瀉和敗血癥等，給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失�？咕�藥物的應(yīng)用在很大程度上控制了這類病原菌的發(fā)生。但是隨著藥物的廣泛使用，尤其不合理用藥，耐藥細(xì)菌迅速產(chǎn)生，多重耐藥現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，嚴(yán)重影響抗菌藥物的有效使用，給新藥的開發(fā)帶來巨大壓力，同時也帶來了動物源食品的安全性問題，對人類的健康構(gòu)成了潛在威脅[1,2]。本次實驗初步了解了各場大腸桿菌耐藥性的發(fā)生和流行現(xiàn)狀，為養(yǎng)殖場合理用藥提供依據(jù)。

一、實驗原理

將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測定菌的瓊脂平板上，紙片中所含的藥物吸取瓊脂中的水分，溶解后便不斷的向紙片周圍區(qū)域擴(kuò)散形成遞減的梯度濃度。在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)測試菌的生長被抑制，從而形成透明的抑菌圈。該抑菌圈表示藥物對該種細(xì)菌的生長繁殖具有抑制作用。通過測定抑菌圈的直徑大小，可以判定藥物的抑菌強(qiáng)弱，抑菌圈直徑越大表示藥物抑菌作用越強(qiáng)，抑菌圈直徑越小表示藥物抑菌作用弱，沒有抑菌圈表示該藥物沒有抑菌作用。并且，經(jīng)稀釋法測得的MIC的對數(shù)和用紙片測定相應(yīng)的菌株得到的抑菌直徑之間大致呈直線相關(guān)，因此將兩種方法相對應(yīng)地測試各種據(jù)菌株所得數(shù)據(jù)，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)的相關(guān)回歸分析處理，可得到一條回歸線，依此可推斷該菌株的MIC，兩者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，即MIC愈小，抑菌圈直徑愈大。二、實驗材料

1.藥品及細(xì)菌諾氟沙星、新霉素、硫酸鏈霉素、氟苯尼考、卡那霉素、泰樂菌素、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、MH營養(yǎng)肉湯、MH瓊脂培養(yǎng)基、大腸桿菌。

2.器材紙片、試管、移液器、烘箱、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)箱、鑷子、1000ml燒杯、PH試紙、量筒、天平、高壓滅菌鍋、三角瓶、打孔器。三、實驗步驟1.培養(yǎng)基的制備：

MH（Mueller-Hinton）瓊脂平板的制備方法：組成：牛肉粉

300g17.5g1.5g

水解酪蛋白可溶性淀粉

蒸餾水加至1000ml，pH調(diào)制7.4±0.2，（約每升含Ca2+500mg、Mg2+25mg）

按上述配比稱取各試劑于燒杯內(nèi)加入蒸餾水加熱溶解，調(diào)整pH值，使其高壓滅菌后的pH

為7.4，加蒸餾水至所需的體積，放于三角瓶內(nèi)，用棉塞塞好，以15～20磅壓力滅菌20min，后趁熱倒入預(yù)先滅菌過的培養(yǎng)皿中，平放冷卻，即為MH肉湯培養(yǎng)基。

注：有的菌不在其中生長者，可在其中加入5～10g葡萄糖或5%（體積分?jǐn)?shù)）羊血或10%（體積分?jǐn)?shù)）兔血清。

MH瓊脂平板就是在上述培養(yǎng)基中加入17g的瓊脂粉即可。2.藥敏紙片的制備2.1紙片制備

選擇優(yōu)質(zhì)新華1號濾紙，用打孔器制成直徑6mm的圓形濾紙片。每200張一管，經(jīng)120℃2h滅菌后備用。2.2藥物稀釋

每張以吸入20μL藥液為標(biāo)準(zhǔn)，如紙片薄，藥物原液需作調(diào)整。根據(jù)紙片內(nèi)各種抗菌藥物的不同濃度配制藥物原液，其濃度需比紙片濃度大200倍，如青霉素G的紙片為10U/片，青霉素G的原液濃度為201*U/mL，200張紙片內(nèi)即加入1mL青霉素G原液。藥液濃度見下表。

紙片內(nèi)抗菌藥物含量抗生素甲氧苯青霉素氨芐青霉素羧芐青霉素大環(huán)內(nèi)酯類桿菌肽頭孢菌素類紙片濃度U/μg/片5μg10μg抗生素卡那霉素鏈霉素紙片濃度U/μg/片30μg10μg10μg10μg30μg30μg抗生素紙片濃度U/μg/片2μg30μg300U30μg15μg5μg氯林肯霉素（對陽性菌）萬古霉素多粘菌素B四環(huán)素類紅霉素利福平100μg妥布霉素15μg10U30μg慶大霉素新生霉素新霉素2.3紙片浸潤、干燥、保存

用無菌操作法將待測的抗菌藥物溶液1ml（含藥量按表所列計算，例如，慶大霉素10μg/片×100片=1000μg/ml），加入攤布于滅菌平皿中的100片紙片中，置冰箱內(nèi)浸泡1~2小時，必要時可不時翻動，使濾紙片將藥液均勻吸凈，如立即實驗可不烘干，若保存?zhèn)溆每捎孟铝幸环N方法烘干（干燥的抗菌素紙片可保存6個月）。

A．培養(yǎng)皿烘干法將浸有抗菌藥液的紙片攤平在培養(yǎng)皿中，于37℃溫箱內(nèi)保持2~3h即可干燥，或放在無菌室內(nèi)過夜干燥。

B．真空抽干法將放有抗菌藥物紙片的試管置于干燥器了，用真空抽氣機(jī)抽干。

紙片的保存將制好的各種藥物紙片裝入無菌小瓶中置冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆�。（紙片不�?yīng)長期保存于常開的普通冰箱中，也不要放在其他不能維持適宜溫度的容器中。）收到紙片后應(yīng)立即保存在-20~4℃中，由于實驗室冰箱頻繁地開關(guān)而不能維持適宜的溫度，故常開的冰箱中只能放置1周使用的紙片；紙片容器打開前先置室溫平衡（裝紙片的容器自冰箱取出后，必須在室溫10min以上才能打開，如立即打開，空氣中的水分會冷凝在紙片上，易潮解），紙片貼畢應(yīng)把未用完的放回冰箱中。3.細(xì)菌的制備

從瓊脂平板挑取新鮮分離的菌落數(shù)個或從保存的斜面上移種至3～5mLMH肉湯培養(yǎng)液中37℃培養(yǎng)2～8h，以待生長至輕微或中等濁度。也可直接從孵育18～24h的瓊脂平板上挑去純菌落制成肉湯。

為保證藥敏試驗的準(zhǔn)確度和精度，必須對接種菌液的濃度做相應(yīng)的控制。因此，將菌液稀釋并校正濁度至0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)濃度，稀釋時使用無菌肉湯或生理鹽水，此時菌液的濃度約為1.5×108個/L。

下表為麥?zhǔn)媳葷峁苤品ǎ涸嚬埽�口徑相等�?0g/LBaCl2（mL）1%純硫酸123456789100.10.20.30.40.50.60.70.80.91.09.99.89.79.69.59.49.39.29.19.06912151821242730相當(dāng)細(xì)菌數(shù)（億/mL）3

4.接種平板

制備好的接種菌液必須在15min內(nèi)使用。用滅菌好的棉試子蘸取菌液，在管壁上旋轉(zhuǎn)擠

壓幾次，去掉過多的菌液。然后用試子涂布整個培養(yǎng)基表面，反復(fù)幾次，每次將平板旋轉(zhuǎn)60°，最后沿平皿周邊繞兩圈，保證涂布均勻。5.粘貼藥敏試紙

待平板上的水分被瓊脂完全吸收后開始貼紙片。用鑷子取紙片一張，貼在瓊脂平板表面，

用鑷子尖輕壓，使其貼平，紙片一旦貼上就不能再拿起，因為紙片中的藥物已經(jīng)擴(kuò)散到瓊脂中。紙片間距離不小于24mm，紙片中心距平皿邊緣不小于15mm。直徑為90mm的平板最好貼6張。貼好紙片后，需在15min內(nèi)置35℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)時，平板需在培養(yǎng)箱內(nèi)單獨(dú)擺放，否則中間的平板達(dá)不到培養(yǎng)箱內(nèi)的溫度而產(chǎn)生預(yù)擴(kuò)散作用，平板培養(yǎng)18～24h后，讀取結(jié)果。四、結(jié)果判定

培養(yǎng)后取出平板，測量抑菌圈的直徑。抑菌圈的邊緣以肉眼看不到細(xì)菌明顯生長為限。有的菌株可出現(xiàn)蔓延生長進(jìn)入抑菌圈，磺胺類藥的抑菌圈內(nèi)會出現(xiàn)輕微生長，這些均不作為抑菌圈邊緣。按抑菌圈直徑判斷細(xì)菌的敏感性。

抑菌圈直徑（mm）20mm及以上15～20mm10～14mm10mm以下0mm五、實驗結(jié)果

大腸桿菌對7種藥物的敏感性抑菌藥物卡那霉素新霉素氟苯尼考抑菌圈直徑（mm）敏感度22.56高敏23.16高敏25.62高敏敏感度極敏高敏中敏低敏不敏多黏菌素諾氟沙星泰樂菌素

六、結(jié)果分析與討論

9.6123.5823.63低敏高敏高敏1.抗菌藥物敏感性試驗方法－紙片擴(kuò)散法

藥敏試驗，是指對敏感性不能預(yù)測的分離菌株進(jìn)行試驗，測試抗菌藥在體外對病原微生物有無抑制作用，以指導(dǎo)選擇治療藥物和了解區(qū)域內(nèi)常見病原菌耐藥性變遷，有助于經(jīng)驗性治療選藥�？咕�藥物敏感性試驗方法很多，常見有紙片擴(kuò)散法，稀釋法，E試驗。本實驗中采用紙片擴(kuò)散法，操作簡便，所需器材簡單。通過此試驗可以幫助我們學(xué)習(xí)了解細(xì)菌對藥物的敏感試驗的常用方法，并根據(jù)這一原理,測定抗菌藥物的質(zhì)量,防偽劣假冒產(chǎn)品和過期失效藥物。

2.實驗中大腸桿菌的耐藥情況

大腸桿菌對24種抗菌藥物的敏感性如上表所示。從表中可以看出，大腸桿菌對多粘菌素的敏感性較低外，對諾氟沙星、新霉素、氟苯尼考、卡那霉素、泰樂菌素等5種抗菌藥物抗菌藥物都顯示很高的敏感性。

由此可見，實驗中所采用的大腸桿菌還未產(chǎn)生明顯的耐藥性。該株大腸桿菌對多粘菌素的敏感性明顯降低，說明其耐藥性有上升趨勢，應(yīng)注重平時抗生素的合理使用。3.實驗中抗生素的主要作用

諾氟沙星具廣譜抗菌作用，尤其對需氧革蘭陰性桿菌的抗菌活性高，對腸桿菌科的大部

分細(xì)菌在體外具良好抗菌作用，體外對多重耐藥菌亦具抗菌活性。諾氟沙星為殺菌劑，通過作用于細(xì)菌DNA螺旋酶的A亞單位，抑制DNA的合成和復(fù)制而導(dǎo)致細(xì)菌死亡。

新霉素對葡萄球菌、棒狀桿菌屬有良好作用，對大腸埃希菌、克雷伯菌屬、變形桿菌屬等腸桿菌科細(xì)菌亦有良好作用，對各組鏈球菌、肺炎鏈球菌、腸球菌屬等活性差，銅綠假單胞菌、厭氧菌等對本品耐藥。

鏈霉素對許多革蘭陰性桿菌如大腸埃希菌、克雷伯菌屬、變形桿菌屬、腸桿菌屬、沙門菌屬、志賀菌屬、布魯菌屬、巴斯德桿菌屬等也具抗菌作用；腦膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌亦對該品敏感。鏈霉素對葡萄球菌屬及其他革蘭陽性球菌的作用差。各組鏈球菌、銅綠假單胞菌和厭氧菌對該品耐藥。

氟苯尼考對多種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌及支原體等均有作用。

泰樂菌素在臨床上主要用于治療和預(yù)防由支原體、金黃葡萄球菌、化膿桿菌、肺炎雙球菌、丹毒桿菌、副嗜血桿菌、腦膜炎奈瑟氏菌、巴氏桿菌、螺旋體、球蟲等病原體引起的各種呼吸道、腸道、生殖道和運(yùn)動系統(tǒng)感染。并且對預(yù)防和治療畜禽在暴發(fā)病毒性疾病時支原體的繼發(fā)感染有很好療效，是世界公認(rèn)治療和預(yù)防畜禽支原體感染的首選藥物，效果優(yōu)于紅霉素和泰妙菌素。

4.控制細(xì)菌耐藥性的主要對策[3~6]

4.1普及相關(guān)醫(yī)療知識，合理使用抗菌藥物

細(xì)菌耐藥性的出現(xiàn)主要是在臨床上濫用抗生素的結(jié)果。特別是在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中，基層人員缺乏相關(guān)的知識，認(rèn)為只要加大劑量、延長療程使用就一定能控制疾病，而全然不考慮藥物的殘留和耐藥性的產(chǎn)生。因此，應(yīng)加強(qiáng)基層醫(yī)務(wù)人員的相關(guān)醫(yī)療知識，用藥時要嚴(yán)格掌握適應(yīng)癥、適當(dāng)?shù)膭┝亢童煶蹋�既要避免劑量過大造成的藥物浪費(fèi)和毒性反應(yīng)的出現(xiàn)，又要注意劑量不足而導(dǎo)致疾病的復(fù)發(fā)及耐藥性的產(chǎn)生。嚴(yán)格掌握抗菌藥物的局部用藥、預(yù)防用藥和聯(lián)合用藥，避免濫用。在控制動物疾病時盡量減少抗菌藥物的使用，最好的方法是改善動物的飼養(yǎng)條件，防止疾病發(fā)生。4.2加強(qiáng)藥政管理

嚴(yán)格控制抗菌藥物的審批、生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)，加強(qiáng)抗菌藥物的質(zhì)量監(jiān)督，控制抗菌藥物的使用管理。

4.3研制和開發(fā)新的藥物

根據(jù)細(xì)菌耐藥性的發(fā)生機(jī)制及其與抗菌藥物結(jié)構(gòu)的關(guān)系，尋找和研制具有抗菌活性，尤其對耐藥菌有活性的新抗菌藥；同時可以針對某些因細(xì)菌滅活酶而失效的抗菌藥物，尋找適當(dāng)?shù)拿敢种苿�，與抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用時可保護(hù)藥物不受滅活酶的破壞而保存其抗菌活性。4.4開發(fā)不使用抗菌藥來治療感染的治療策略

參考文獻(xiàn)：

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154(30):60~63

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