Leica全自動染色封片工作站的使用體會

Leica全自動染色封片工作站的使用體會

隨著病理學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，全自動染色封片一體化工作站以其卓越的性能和良好的處理效果，特別是其穩(wěn)定、高效的染色過程，逐漸被各大醫(yī)院和相關(guān)實驗室接受并使用，并逐步替代目前的人工染色。自將工作站應(yīng)用于常規(guī)HE染色以來，經(jīng)過近10萬例的實際應(yīng)用，切片染色效率明顯提高，染色效果穩(wěn)定，染色質(zhì)量顯著改觀。1材料與方法1.1儀器設(shè)備

德國Leica","p":{"h":16.932,"w":37.603討論

傳統(tǒng)手工染色操作繁瑣，勞動強度大，溫度、時間、試劑、環(huán)境、個體差異等因素皆可影響染色效果，不適合大批量標(biāo)本的染色處理。而全自動組織切片染色機因其獨特的以人為本的智能化設(shè)計理念、周到而完善的處理程序，不但極大地保證了切片染色質(zhì)量的高效性、穩(wěn)定性，還可以減輕工作強度和改善工作環(huán)境。3.1優(yōu)點

3.1.1效率高可進行批量標(biāo)本的染色，最多12個染色架同時染色，每個染色架裝30張切片，并可同時運行多個程序，尤其適用于標(biāo)本量大的單位。與傳統(tǒng)手工染色相比，染色同時工作人員可進行其他工作（如切片），工作時間統(tǒng)籌化，整體工作效率得以提高。

3.1.2穩(wěn)定性好染色封片工作站的各步驟均由單片機控制，時間控制精準(zhǔn)、嚴(yán)密。在程序設(shè)定合理的前提下，染色效果更穩(wěn)定[3]。有報道，室溫低于15℃時染色效果不佳，應(yīng)適當(dāng)提高室溫[2]。我科室日常工作中室溫始終保持在23℃左右，染色效果穩(wěn)定，無明顯差異�？稍O(shè)置數(shù)個精確步驟（如蘇木素、分化），當(dāng)相鄰染色架出現(xiàn)時間沖突時，優(yōu)先確保精確步驟染色。3.1.3保障具有斷電記憶功能，斷電重新啟動后，可以繼續(xù)染色流程，不必從頭重復(fù)染色�？蛇x配UPS電源，在主電源缺乏時持續(xù)供電，保障染色工作繼續(xù)完成。

3.1.4安全工作站在相對密閉的空間中進行染色封片，大大減少了有毒揮發(fā)性試劑（尤其是二甲苯）對工作環(huán)境及工作人員的危害。我科室將染色工作站放于通風(fēng)櫥中，更加有利于對環(huán)境和人員的保護。

3.1.5便于質(zhì)控自動染色機調(diào)整好各步驟時間，可產(chǎn)生精確而連貫的染色、分化、脫水等過程，與傳統(tǒng)染色相比，受人為因素影響較��；同時可以限定各染色切片的數(shù)量，到達(dá)使用期限，機器會自動報警提示，對常規(guī)染色的質(zhì)量控制提供了可靠平臺。3.2日常使用時的注意事項

3.2.1染缸的排列染缸中的液體盡量按照染色步驟依次排列，所有需要沖水的步驟都應(yīng)靠近水缸，并使機械臂行進的路線時間最短化；機械臂前進時有一定的回轉(zhuǎn)，合理設(shè)計避免玻片上的試劑滴入其他染缸造成污染；透明用二甲苯靠近染色機出口位置，便于將玻片快速轉(zhuǎn)入封片機進行封片。

3.2.2試劑的使用與更換根據(jù)實際工作情況，我科使用成品Harris蘇木素染液（珠海貝索），染片約2500張；使用0.5%水溶性伊紅，滴加1～2滴冰醋酸促染，染片約","p":{"h":15.839,"w":15.84,"x":631.95,"y":451.768,"z":90},"ps":null,"t":"word",綜上所述，全自動染色封片工作站操作簡單方便，染色效率高效果好，改善工作環(huán)境。除應(yīng)用于常規(guī)HE染色外，在部分特殊染色和快速冰凍切片染色中也得到較好應(yīng)用，充分發(fā)揮其優(yōu)勢，更好促進病理技術(shù)的發(fā)展。

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新型全自動免疫組化染色機在臨床工作中高標(biāo)準(zhǔn)化應(yīng)用體會

馬鐵，紀(jì)蓮，姜衛(wèi)國

121

（1中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院.病理科；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實驗研究中心動物室，沈陽110004）

摘要目的探討新型全自動免疫組化染色機在臨床病理工作中高標(biāo)準(zhǔn)化操作的應(yīng)用。方法選擇病理

工作中常用的ER、PR、Ki-67、CD3、CD20、P504S、P63、CK等30余種抗體，分別使用其即用型及濃縮型試劑，使用BondPolymerRefineDetection（聚合物精細(xì)檢測）及新型全自動免疫組化染色機進行免疫組化染色。結(jié)果使用即用型一抗染色效果偏強，使用濃縮型一抗達(dá)到最佳染色效果，切片著色均勻，陽性結(jié)果定位準(zhǔn)確，背景清晰，無邊緣效應(yīng)，無非特異性著色。結(jié)論新型全自動免疫組化染色機染色全過程實現(xiàn)機械化，標(biāo)準(zhǔn)化程度高，操作簡便規(guī)范，染色結(jié)果可靠，節(jié)約試劑成本，為臨床病理診斷提供有力依據(jù)。

關(guān)鍵詞全自動；免疫組化；高標(biāo)準(zhǔn)化；染色

Researchonhighstandardizationofthenovelautomaticimmunohistochemistrystainerinclinicalpractice

AbstractObjectiveToexploretheapplicationofthenewautomaticimmunohistochemicalstainingmachineinclinicalpathologywithhigh-standard.MethodsMorethan30kindsofcommonantibodies(ER,PR,Ki-67,CD3,CD20,P504S,P63,CK,etal,includingimmediateandconcentratedtype,respectively)ischosentostainwithBondPolymerRefineDetection(polymerfinedetection)andthenewautomaticimmunohistochemicalstainingmachine.ResultsThedyeingeffectoftheimmediatetypeisstronger.Tousetheconcentratedcanachievethebestdyeingeffect,withcoloruniformity,accuratepositioningofpositiveresults,clearbackground,withoutedgeeffectandnon-specificcolor.ConclusionThenewautomaticimmunohistochemistrystainingmachineismechanizationduringthewholeprocess,highstandardizationdegree,simpleandnormativeoperation,reliabledyeingresults,reagentsaving

cost,canprovideastrongbasisforclinicalpathologydiagnosis.Keywords:

目前國內(nèi)多數(shù)醫(yī)院病理科使用自動免疫組化染色機進行免疫組化染色

［1］

。但多數(shù)自動

免疫組化染色機未完全實現(xiàn)“全自動”（如不能進行脫蠟及抗原修復(fù)等），某些步驟還需要手工操作。此外，操作時還需用免疫組化筆對染色區(qū)域進行劃定；若玻片清潔度不佳、染色架傾斜等，會出現(xiàn)染色不均現(xiàn)象

［2］

。這在不同程度上制約了免疫組化染色標(biāo)準(zhǔn)化的發(fā)展

［3］

。

我科室近年使用德國Leica公司生產(chǎn)的BOND-MAX型全自動免疫組化染色機，該染色機全過程實現(xiàn)機械化，標(biāo)準(zhǔn)化程度高，操作簡便規(guī)范。筆者在使用過程中有如下體會。1.材料與方法

1.1材料用防脫載玻片常規(guī)制備3μm厚各種常用一抗陽性對照切片若干張，經(jīng)62℃烤片2小時后備用（以下簡稱待檢切片）。

1.2儀器設(shè)備德國Leica公司全自動免疫組化染色操作儀，計算機，手持式ID掃描儀，玻片標(biāo)簽儀，Covertile（玻片蓋）。

1.3試劑ER、PR、Ki-67、CD3、CD20、P504S、P63、CK等30余種一抗，BondPolymerRefineDetection（聚合物精細(xì)檢測），洗滌溶液，抗原修復(fù)液，脫蠟溶液。

1.4實驗方法設(shè)立3個實驗組：即用型一抗試劑組、與即用型一抗試劑相對應(yīng)同種濃縮型一抗試劑組（以下簡稱濃縮型一抗試劑組）、以及陰性對照組。使用新型全自動免疫組化染色機進行免疫組化染色。

⑴即用型一抗試劑組：將待檢切片貼上標(biāo)簽放入染色機中，按染色機操作流程，結(jié)合一抗說明書要求設(shè)定是否進行抗原修復(fù)、抗原修復(fù)液種類及修復(fù)時間，使用市售即用型一抗試劑對待檢切片進行免疫組化染色，鏡檢，觀察結(jié)果。

⑵濃縮型一抗試劑組：用抗體稀釋液將常用濃縮型一抗試劑按說明書推薦效價進行倍比稀釋，按染色機操作流程使用倍比稀釋后的一抗對待檢切片進行免疫組化染色，直至一抗倍比稀釋后的濃度染色出現(xiàn)弱陽性或陰性結(jié)果，鏡檢，觀察結(jié)果。

⑶陰性對照組：用PBS緩沖液代替一抗，按染色機操作流程對任意待檢切片進行免疫組化染色，鏡檢，觀察結(jié)果。

1.5染色機操作流程⑴啟動Bond軟件，進入Bond操作系統(tǒng)。⑵輸入病例詳細(xì)信息：包

括病理號、試劑滴加容量、制備操作規(guī)程、玻片詳細(xì)信息（是否烤片、脫蠟等）、抗原修復(fù)方式

［4、5］

等。⑶經(jīng)玻片標(biāo)簽儀打印標(biāo)簽，將標(biāo)簽貼在待檢組織切片磨砂側(cè)。⑷待檢組織切

片放入玻片架凹槽內(nèi)。⑸Covertile（玻片蓋）覆蓋于切片表面。⑹玻片架放入染色機中。⑺各種一抗按各自效價稀釋好裝進試劑瓶內(nèi)，放入染色機中。⑻BondPolymerRefineDetection（聚合物精細(xì)檢測）放入染色機中。⑼檢查洗滌溶液、抗原修復(fù)液、脫蠟溶液、酒精等大容量試劑瓶中試劑量是否充足。⑽一切準(zhǔn)備就緒，儀器開始運行，直至蘇木精復(fù)染結(jié)束。⑾取下切片，經(jīng)脫水、透明、中性樹膠封固。2結(jié)果

經(jīng)全自動免疫組化染色機進行免疫組化染色標(biāo)記，即用型一抗試劑組ER、PR、Ki-67、CD3、CD20、P504S、P63、CK等30余種切片染色效果均偏強，陽性結(jié)果定位準(zhǔn)確，背景較清晰（如圖1）；

濃縮型一抗試劑組在說明書推薦效價內(nèi)的ER、PR、Ki-67、CD3、CD20、P504S、P63、CK等30余種一抗?jié)舛惹衅�染色效果亦均偏強，陽性結(jié)果定位準(zhǔn)確，背景較清晰；而達(dá)到最佳染色效果切片的一抗?jié)舛染�高于說明書推薦效價，切片著色均勻，陽性結(jié)果定位準(zhǔn)確，背景清晰，無邊緣效應(yīng)，無非特異性著色（如圖2）；

陰性對照組切片無DAB著色，細(xì)胞核藍(lán)染，背景清晰。

圖1乳腺浸潤性導(dǎo)管癌，PR細(xì)胞核陽

性，一抗選用市售即用型抗體，細(xì)胞核大部分棕黃色，濃染，局灶間質(zhì)纖維細(xì)胞著色200×

圖2乳腺浸潤性導(dǎo)管癌，PR細(xì)胞核陽

性，一抗選用濃縮型抗體1:4000倍稀釋，細(xì)胞核大部分棕黃色，著色均勻，定位準(zhǔn)確，背景清晰200×

3體會

近年來，病理學(xué)界大力倡導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量控制，在新抗體、新技術(shù)不斷涌現(xiàn)的今天，免疫組化檢測標(biāo)準(zhǔn)化不僅為疾病的診斷提供有力幫助，對臨床治療也發(fā)揮越來越多的指導(dǎo)作用。新型全自動免疫組化染色機是病理科實現(xiàn)高標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量控制的便捷而可靠的工具。

⑴全程實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化。該染色機有玻片加熱功能，切片后可直接進行烤片、脫蠟、抗原修復(fù)等工作，各步驟溫度、時間恒定；抗原修復(fù)時可根據(jù)一抗修復(fù)要求，選用不同抗原修復(fù)液，而且多張切片不同修復(fù)方法可同時進行，避免手工操作易造成混亂。

⑵操作簡便，完全實現(xiàn)自動化。只需將貼好標(biāo)簽的切片及所需試劑放入染色機中，點擊開始按鈕，機器便會根據(jù)標(biāo)簽信息自動完成免疫組化染色全過程（包括烤片、脫蠟、抗原修復(fù)、抗體滴加、蘇木精復(fù)染等），整個流程完全不需要病理技術(shù)人員手工干預(yù)，既使不同的工作人員進行操作也不會出現(xiàn)染色結(jié)果的波動；但操作時應(yīng)注意將相同操作程序的切片放入同一玻片架（如有的切片需進行烤片，有的切片不需進行烤片應(yīng)分別放于不同的玻片架）。

⑶BondPolymerRefineDetection（聚合物精細(xì)檢測）靈敏度較高，使用市售即用型一抗染色效果偏強，必須稀釋一定倍數(shù)后使用，因同種不同批次即用型一抗試劑售出時稀釋濃度不盡相同，故每次更換一抗均需對新抗體和檢測系統(tǒng)進行最佳實驗條件的預(yù)試驗，以確定一抗最佳稀釋濃度，這無形中增加技術(shù)人員的工作量，同時也造成檢測系統(tǒng)試劑浪費。筆者在大量工作中不斷摸索，反復(fù)試驗，發(fā)現(xiàn)如使用濃縮型一抗，可較好解決此問題。只需在第一次購入時對抗體和檢測系統(tǒng)進行最佳實驗條件的預(yù)試驗，確定一抗最佳稀釋濃度，消耗殆盡時再訂購?fù)�一試劑廠家產(chǎn)品，按上次預(yù)試驗確定的稀釋濃度稀釋即可。而且在實際工作中一抗最佳稀釋度往往高于試劑說明書建議稀釋度（如PR抗體，試劑說明書建議稀釋濃度為1:100～1:200，但筆者經(jīng)過預(yù)實驗確定最佳稀釋度為1:4000），大大節(jié)約了訂購一抗試劑的成本。但值得注意的是每次不可配置過多，應(yīng)少配勤配，防止使用時間過長導(dǎo)致效價下降，影響染色結(jié)果。

⑷采用獨特設(shè)計Covertile（玻片蓋），可使試劑均勻覆蓋于組織表面，避免染色過程中干片，使組織染色均勻一致，而且省去多數(shù)免疫組化染色機用免疫組化筆劃定試劑加入范圍的過程，省時省力；但玻片架送入染色機時不可用力過大，否則易造成Covertile（玻片蓋）錯位，導(dǎo)致試劑不能正常加入。Covertile（玻片蓋）使用后表面會有DAB殘留物附著，可用新配制的“健之素牌消毒片”（其有效成份為三氯異氰尿酸）浸泡2-4小時，然后用流水沖洗，再用70%乙醇浸泡2分鐘，或用蒸餾水洗三次，每次3分鐘，晾干備用。筆者發(fā)現(xiàn)若用流水沖洗后直接晾干，易產(chǎn)生水漬；若用100%乙醇浸泡，易導(dǎo)致Covertile（玻片蓋）出現(xiàn)裂紋，影響染色效果。

⑸染色機上有水平指示裝置，可隨時觀察染色機水平狀態(tài)，從而防止因?qū)嶒炁_面傾斜而導(dǎo)致切片染色不均。

⑹洗滌溶液、抗原修復(fù)液、脫蠟溶液、酒精等大容量試劑瓶中無液面感應(yīng)裝置，每次運

行前均需對這些試劑容量進行檢查，確保充足后，再進行染色。

⑺此機廢液采用有害和無害分瓶處理方式，有害廢液可集中統(tǒng)一處理，避免對周圍環(huán)境造成污染，有利于環(huán)保健康。

綜上所述，按照國際免疫組織化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化的要求，在病理實驗室中成功開展免疫組織化學(xué)技術(shù)的關(guān)鍵是標(biāo)準(zhǔn)化。新型全自動免疫組化染色機真正實現(xiàn)全自動操作，標(biāo)準(zhǔn)化程度高，操作方便，而且染色結(jié)果可靠，背景清晰，重復(fù)性好。但全自動染色機也不是萬無一失的，要做好每一張免疫組化切片，除了要注意以上事宜，還要求病理技術(shù)人員具有高度的責(zé)任感和精益求精的工作作風(fēng)，需經(jīng)常檢查設(shè)備運行狀況，注意染色操作中的各個細(xì)節(jié)，每次染色后均要進行染色結(jié)果“初審”，在顯微鏡下觀察是否定位準(zhǔn)確，發(fā)現(xiàn)問題及時調(diào)整和解決，這樣才能為病理診斷提供可靠的依據(jù)。參考文獻：

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具體修改意見見文中，修改后發(fā)表。

補充作者簡介：內(nèi)容包括作者姓名（出生年），性別，籍貫，職稱，學(xué)位，主要研究方向。補充英文關(guān)鍵詞，需與中文相對應(yīng)。參考文獻4補充頁碼。

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