《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)》教學(xué)大綱07應(yīng)化

《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)》教學(xué)大綱

課程代碼：

課程名稱:生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)課程類別：職業(yè)技能培訓(xùn)類修習(xí)類別：必修實(shí)驗(yàn)學(xué)分：1學(xué)分實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)：36學(xué)時(shí)先修課程：生物化學(xué)授課對(duì)象：應(yīng)用化學(xué)

承擔(dān)實(shí)驗(yàn)室：實(shí)驗(yàn)樓B508生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室

一、教學(xué)目標(biāo)

生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)的方法和技術(shù)是生物科學(xué)以及其他相關(guān)研究領(lǐng)域中的一個(gè)非常重要和強(qiáng)有力的工具。通過生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)這門課程的學(xué)習(xí)，能使學(xué)生掌握生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)的基本操作及實(shí)驗(yàn)技術(shù)，掌握生物大分子的分離純化、定性、定量、化學(xué)性質(zhì)、生物活性的鑒定，掌握和了解組織代謝和能量釋放轉(zhuǎn)變和貯存與代謝調(diào)節(jié)過程中的代謝產(chǎn)物和間產(chǎn)物的定性、定量分析鑒定實(shí)驗(yàn)；學(xué)生分析問題和解決問題的能力及實(shí)驗(yàn)動(dòng)手能力將得到訓(xùn)練，并能熟練掌握各種生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)儀器的使用以及準(zhǔn)確詳實(shí)記錄實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象和數(shù)據(jù)的技能。

二、實(shí)驗(yàn)課程基本理論

本門實(shí)驗(yàn)課程以生物化學(xué)理論課為基礎(chǔ)，在此基礎(chǔ)上使學(xué)生能夠熟練掌握各種常規(guī)的實(shí)驗(yàn)儀器。

三、實(shí)驗(yàn)方式及基本要求

為達(dá)到教學(xué)目的，實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)教師對(duì)學(xué)生實(shí)驗(yàn)應(yīng)進(jìn)行的指導(dǎo)：

1、實(shí)驗(yàn)方式：教師講解實(shí)驗(yàn)過程及相關(guān)注意事項(xiàng)，學(xué)生自己動(dòng)手操作，教師全程指導(dǎo)。2、預(yù)習(xí)要求：應(yīng)與理論課所學(xué)習(xí)的相應(yīng)部分相結(jié)合，初步了解實(shí)驗(yàn)原理和反應(yīng)過程等。3、實(shí)驗(yàn)操作方面要求：應(yīng)做到規(guī)范、到位，及時(shí)觀察與記錄實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象和數(shù)據(jù)，并特別強(qiáng)調(diào)

注意事項(xiàng)中設(shè)計(jì)的操作，弄清每一步實(shí)驗(yàn)操作的設(shè)計(jì)依據(jù)，并深入理解實(shí)驗(yàn)原理和反應(yīng)過程等。

4、實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求：應(yīng)詳細(xì)寫出實(shí)驗(yàn)原理、操作步驟、實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象、注意事項(xiàng)，并解答實(shí)驗(yàn)中

要求完成的計(jì)算等題目，必要時(shí)要總結(jié)實(shí)驗(yàn)成功的收獲或失敗的教訓(xùn)。

四、教學(xué)內(nèi)容及學(xué)時(shí)分配

序號(hào)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)4實(shí)驗(yàn)類型演示性實(shí)驗(yàn)內(nèi)容提要介紹并安排常規(guī)玻璃器皿、離心管等實(shí)驗(yàn)儀器的洗滌要求1儀器使用方法與器皿洗滌2蛋白質(zhì)含量的測定3氨基酸的呈色反應(yīng)、蛋白質(zhì)的變性、沉淀和PI測定66綜合性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)從小白菜中葉片提取液中測定蛋白質(zhì)含量，采用福林酚法和考馬斯亮藍(lán)G-250法通過雙縮脲反應(yīng)、茚三酮證明氨基酸的顏色反應(yīng)，采用重金屬、加熱、調(diào)節(jié)pH值等方式驗(yàn)證蛋白質(zhì)的變性、復(fù)性、沉淀等性質(zhì)并測定其PI。采用微量凱氏定氮法測定雞蛋清的含氮量，從而測定雞蛋清中蛋白質(zhì)的含量。分別測定水果和淀粉中還原糖和總糖的含量并進(jìn)行比較。采樣稀釋的唾液淀粉酶，通過溫度、pH值等的變化顯示其對(duì)酶的活性的影響。4生物物質(zhì)含氮量的測定5還原糖和總糖的測定6DNA的Tm值測定溫度、pH值對(duì)酶活性的影響7考試6662設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)綜合性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

五、考核方式及成績?cè)u(píng)定

本門課程采用考查方式，各次實(shí)驗(yàn)報(bào)告平均分占總成績的70％，實(shí)驗(yàn)操作、考勤、衛(wèi)生值日等占30％。

六、配套教材或指導(dǎo)書

采用自編教材，參考書目如下：

1.《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)（第一版）》，陳曾燮等主編，中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)出版社，1994年1月2.《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)（第一版）》，余冰賓主編，清華大學(xué)出版社，201*年1月3.《生物化學(xué)技術(shù)原理及其應(yīng)用（第二版）》，趙永芳編著，武漢大學(xué)出版社，1994年6月

執(zhí)筆：唐紅楓審閱：

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《生物化學(xué)》實(shí)驗(yàn)教學(xué)大綱201*

1、課程屬性：必修2、實(shí)驗(yàn)屬性：非獨(dú)立設(shè)課3、學(xué)時(shí)學(xué)分：實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)224、實(shí)驗(yàn)應(yīng)開學(xué)期：秋季

5、先修課程：有機(jī)化學(xué)、分析化學(xué)、普通化學(xué)

一、課程的性質(zhì)與任務(wù)

生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)課是在學(xué)習(xí)生物化學(xué)理論課的基礎(chǔ)上進(jìn)行的一個(gè)實(shí)踐性環(huán)節(jié)，本課程的教學(xué)任務(wù)是讓學(xué)生運(yùn)用已學(xué)過的知識(shí)驗(yàn)證一些結(jié)論、結(jié)果和現(xiàn)象，及綜合運(yùn)用已學(xué)過的理論知識(shí)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)或進(jìn)行綜合性的實(shí)驗(yàn)，鞏固和加深對(duì)生物化學(xué)課程中基本理論知識(shí)的理解，訓(xùn)練學(xué)生理論知識(shí)的運(yùn)用能力、實(shí)驗(yàn)操作技能、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理和分析能力。

二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c基本要求

本實(shí)驗(yàn)課配合理論教學(xué)，通過實(shí)驗(yàn)從實(shí)踐中進(jìn)一步學(xué)習(xí)，掌握和運(yùn)用學(xué)過的基本理論；運(yùn)用生物化學(xué)理論分析實(shí)驗(yàn)過程中的各種現(xiàn)象和問題，培養(yǎng)、訓(xùn)練學(xué)生的分析和解決問題的能力。

學(xué)生必須完成的基本要求：準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)，預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)；寫出預(yù)習(xí)報(bào)告，擬定記錄表格；測取實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)；整理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)；寫出實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

三、實(shí)驗(yàn)考核方式及辦法

考核方式：考查；實(shí)驗(yàn)成績占總成績的30%，實(shí)驗(yàn)成績?cè)u(píng)分辦法：實(shí)驗(yàn)操作占40%，實(shí)驗(yàn)態(tài)度占20%，實(shí)驗(yàn)報(bào)告占40%。

四、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目一覽表

生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目一覽表

序號(hào)

1234567

血清球蛋白的分離--分子篩凝膠層析法醋酸纖維薄膜電泳法分離動(dòng)物血清蛋白質(zhì)血清乳酸脫氫酶同工酶的分離與測定動(dòng)物肝臟DNA的提取紫外吸收法測定核酸含量

應(yīng)用紙層析法鑒定酶促轉(zhuǎn)氨基作用維生素C含量的測定

驗(yàn)證性驗(yàn)證性綜合性驗(yàn)證性綜合性綜合性綜合性

必做必做必做必做必做必做必做

農(nóng)科類農(nóng)科類農(nóng)科類農(nóng)科類農(nóng)科類農(nóng)科類農(nóng)科類

4333333

實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目名稱

實(shí)驗(yàn)類型

實(shí)驗(yàn)要求

適用專業(yè)

學(xué)時(shí)五、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的具體內(nèi)容

實(shí)驗(yàn)一血清球蛋白的分離------分子篩凝膠層析法

1、本次實(shí)驗(yàn)的目的和要求

學(xué)習(xí)和掌握分子凝膠層析法的原理和技術(shù)（溶脹，裝柱，加樣和洗脫），了解葡聚糖凝膠的選用原則2、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容或原理

分子篩指的是一些多孔介質(zhì)。當(dāng)含有不同大小分子的混合物流經(jīng)這一介質(zhì)時(shí)，小分子的物質(zhì)能進(jìn)入介質(zhì)的孔隙，而大分子的物質(zhì)則被排阻在介質(zhì)之外，從而達(dá)到分離的目的，這種作用稱為"分子篩效應(yīng)”。當(dāng)用含有硫酸銨和球蛋白的混合物進(jìn)行上樣時(shí)，球蛋白最先被吸脫下來，硫酸銨后被吸脫下來，從而達(dá)到分離的目的。3、需用的儀器和試劑

層析柱、試管、鐵架臺(tái)、恒壓瓶

飽和硫酸銨、10%氫氧化鈉、1%硫酸銅、1%氯化鋇

4、實(shí)驗(yàn)步驟

凝膠的預(yù)處理、裝柱、鹽析、上樣收集、鑒定、數(shù)據(jù)處理；5、教學(xué)方式

學(xué)生為主，教師輔助，充分預(yù)習(xí)，獨(dú)立完成。結(jié)合多媒體幻燈演示6、考核要求

以出勤、隨堂提問、實(shí)驗(yàn)報(bào)告和預(yù)習(xí)報(bào)告等平時(shí)成績?yōu)橹饕�考核�?nèi)容7、實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求

實(shí)驗(yàn)報(bào)告應(yīng)包括下列各項(xiàng)：（1）報(bào)告的題目（要簡明確切）；（2）寫報(bào)告人及共同測定人員的姓名；（3）實(shí)驗(yàn)?zāi)康�；�?）實(shí)驗(yàn)原理；

（5）實(shí)驗(yàn)儀器和試劑（包括主要儀器的規(guī)格、主要試劑的名稱）；（6）實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄（包括原始數(shù)據(jù)記錄表格和整理后的數(shù)據(jù)記錄表格）；（7實(shí)驗(yàn)結(jié)果。明確提出本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)論，用公式計(jì)算或用文字說明

（8）分析與討論，要對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果作出估計(jì)，分析誤差大小及原因，對(duì)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的問題應(yīng)進(jìn)行討論，對(duì)實(shí)驗(yàn)方法、實(shí)驗(yàn)設(shè)備有何改進(jìn)建議也可寫入此欄；（9）回答思考題。

實(shí)驗(yàn)二醋酸纖維薄膜電泳法分離動(dòng)物血清蛋白質(zhì)

1、本次實(shí)驗(yàn)的目的和要求

掌握醋酸纖維薄膜電泳的原理，操作及測定動(dòng)物蛋白質(zhì)的相對(duì)百分含量技術(shù)2、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容或原理

蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在pH值大于其等電點(diǎn)的溶液中成為帶負(fù)電的陰離子，在電場中移向陽極。血清中的數(shù)種蛋白質(zhì)在同一pH條件下由于其解離狀況不同、，帶點(diǎn)不同，在電場中移動(dòng)速度不同，采用電泳法可將其分離。醋酸纖維素是纖維素羥基乙�；�形成的纖維素乙酰酯將它溶于有機(jī)溶劑后，涂抹成均勻的薄膜待溶劑干后即稱為醋酸纖維薄膜。3、需用的儀器和試劑

水平電泳裝置、培養(yǎng)皿、試管、電泳儀、電泳槽、

0.07mol/L巴比妥-巴比妥鈉緩沖液、氨基黑10B、漂洗液、透明液4、實(shí)驗(yàn)步驟

（1）醋酸纖維薄膜的潤濕和選擇

（2）制作電橋：將緩沖液倒入電泳槽中，根據(jù)電泳槽的縱向尺寸，于兩極支架上各放入三層濾紙，濾紙的一端與支架的前端對(duì)齊，另一點(diǎn)進(jìn)入緩沖液中，除去氣泡使濾紙緊貼于支架上，即為紙濾橋。

（3）點(diǎn)樣：無光澤面朝上，在距負(fù)端1.5cm處，蓋玻片點(diǎn)樣注意點(diǎn)樣時(shí)應(yīng)使血清均勻的分布在點(diǎn)樣區(qū)形成有一定寬度粗細(xì)均勻的直線，這是獲得重要清晰區(qū)帶電泳圖譜的重要環(huán)節(jié)之一。可事先在濾紙上練習(xí)點(diǎn)樣。

（4）電泳：將點(diǎn)好樣的薄膜無光澤面向下，兩端貼在電泳槽支架的濾紙上，點(diǎn)樣端在負(fù)極。平衡10min，調(diào)電壓最大，然后調(diào)電流，0.6mA/條，預(yù)電泳10min，調(diào)電流1mA/條，電泳45min關(guān)閉電源.注意電泳過程中防止電壓偏高或偏低.

（5）電泳完畢，取出薄膜直接浸入染色液(.氨基黑10B)中，染色五分鐘（6）漂洗：漂洗液漂洗直至背景染色脫去呈白色，可看出清晰的五條區(qū)帶.

（7）記錄：由正極依次為清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白。記下遷移距離。

（8）透明：甲液2min，乙液1min，寧缺毋濫。取出薄膜貼于載玻片上放置于陰涼處晾干備用

5、教學(xué)方式

學(xué)生為主，教師輔助，充分預(yù)習(xí)，獨(dú)立完成。6、考核要求

同上7、實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求

實(shí)驗(yàn)報(bào)告應(yīng)包括下列各項(xiàng)：（1）報(bào)告的題目（要簡明確切）；（2）寫報(bào)告人及共同測定人員的姓名；（3）實(shí)驗(yàn)?zāi)康�；�?）實(shí)驗(yàn)原理；

（5）實(shí)驗(yàn)儀器和試劑（包括主要儀器的規(guī)格、主要試劑的名稱）；（6）實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄（包括原始數(shù)據(jù)記錄表格和整理后的數(shù)據(jù)記錄表格）；（7實(shí)驗(yàn)結(jié)果。明確提出本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)論，用文字說明（8）分析與討論，要對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果作出估計(jì)，分析誤差大小及原因，對(duì)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的問題應(yīng)進(jìn)行討論，對(duì)實(shí)驗(yàn)方法、實(shí)驗(yàn)設(shè)備有何改進(jìn)建議也可寫入此欄；（9）回答思考題。

實(shí)驗(yàn)三血清乳酸脫氫酶同工酶的分離與測定

（聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳法）

1、本次實(shí)驗(yàn)的目的和要求

掌握盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳的基本原理。學(xué)習(xí)盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作技術(shù)，包括制膠、灌膠、加樣、電泳、剝膠、染色及脫色等。學(xué)會(huì)用盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳分離同工酶。

2、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容或原理

聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺單體和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺，在加速劑和催化劑的作用下聚合而成的具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。血清樣品中含有5種同工酶，在同一pH條件下，解離狀況不同，通過聚丙烯酰胺凝膠具有的濃縮效應(yīng)、分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)將五種同工酶分離。3、需用的儀器和試劑

離心機(jī)、中壓電泳儀，電泳槽、注射器、玻璃管、加樣器、

丙烯酰胺貯液、過硫酸銨、蔗糖、核黃素、乳酸鈉、輔酶I、PMS、NBT4、實(shí)驗(yàn)步驟

（1）貯液及制備（分離膠每份15ml，濃縮膠每份5ml，可供60人使用）

（2）制膠：用注射器在玻璃管管底加入3-4滴蔗糖→加樣器加膠至管高2/3處→加1cm重蒸水水封→放到水浴鍋的試管架上聚合→除去上層水封→加入1cm大孔膠→加1cm重蒸水水封置于燈管下→聚合至凝膠呈乳白色。

（3）安裝：將卸掉皮筋、膠帽、乳膠管的玻璃管裝入圓盤電泳槽中，排出管兩端的氣泡。（4）上樣：樣品組成為：兔血清+40%蔗糖+0.1%溴酚藍(lán)（體積比1：1：1）。上樣80μl。（5）電泳：上槽連接負(fù)極，下槽連接正極。開始時(shí)調(diào)節(jié)電流2mA/管，3min后調(diào)節(jié)電流4mA/管。電泳時(shí)間根據(jù)指示劑染料的遷移來決定，當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑接近凝膠底部1cm時(shí)停止電泳。

（6）剝膠：用注射器吸滿水，從濃縮膠的一端小心的插入到管壁與凝膠之間，轉(zhuǎn)動(dòng)玻璃管同時(shí)推動(dòng)注射器，靠水流的壓力和潤滑作用將玻璃管與凝膠分開，最終使凝膠從玻璃管中脫落。

（7）．染色：避光37℃保溫10-30min，凝膠條上可顯示出紫色的LDH帶。從正極依次為LDH1（H4）、LDH2（H3M）、LDH3（H2M2）、LDH4（HM3）、LDH5（M4）（其中LDH4和LDH5含量較少）

（8）．計(jì)算相對(duì)遷移率：

相對(duì)遷移率=點(diǎn)樣點(diǎn)到各帶的距離/點(diǎn)樣點(diǎn)到染料的距離（9）．染色的固定：將凝膠條放入7%醋酸中脫色和固定。5、教學(xué)方式

學(xué)生為主，教師輔助，充分預(yù)習(xí)，獨(dú)立完成。6、考核要求

考核要求同上。7、實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求

實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求同上。

實(shí)驗(yàn)四動(dòng)物肝臟DNA的提取

1、本次實(shí)驗(yàn)的目的和要求

了解DNA和RNA的不同溶解性質(zhì)。學(xué)習(xí)用鹽溶液法從動(dòng)物組織中提取DNA的原理和操作技術(shù)2、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容或原理

核酸和蛋白質(zhì)時(shí)構(gòu)成生物有機(jī)體的主要成分，在生物體內(nèi)核酸通常是與蛋白質(zhì)結(jié)合成核帶白的形式存在，核蛋白有脫氧核糖核蛋白和核糖核蛋白。在濃的NaCl溶液中，脫氧核糖核蛋白溶解度更大，核糖核蛋白溶解度很小，而在稀的NaCl溶液中，脫氧核糖核蛋白溶解度很小，而核糖核蛋白溶解度很大，因此可利用不同濃度的NaCl溶液將核糖核蛋白和脫氧核糖核蛋白從樣品中分別提取出來.經(jīng)提取到的核蛋白用SDS處理，會(huì)引起蛋白變性而與DNA分開，氯仿—異戊醇可將蛋白沉淀除去，DNA則溶解于溶液中。向溶液中加入適量的冷乙醇，DNA即析出。.3、需用的儀器和試劑

試劑：0.1MNACL-0.05M檸檬酸鈉混合液，5MNaCl，25%SDS，氯仿異戊醇，

95%冷乙醇。

儀器：小燒杯、玻璃棒、大滴管、量筒、離心杯套筒、勻漿器、小天平、稱量紙。4、實(shí)驗(yàn)步驟

(1)細(xì)胞的破碎：取8g新鮮的動(dòng)物內(nèi)臟，用15ml0.1MNaCl-0.05M檸檬酸鈉混合液放入勻漿器中研磨，然后倒出勻漿，4000rpm離心10min，棄去上清液。

(2)洗滌：向沉淀中加入10ml0.1MNaCl-0.05M檸檬酸鈉混合液，玻璃棒攪拌，4000rpm離心，10min，倒掉上清液。

(3)蛋白質(zhì)變性：向沉淀中加入10ml0.1MNaCl-0.05M檸檬酸鈉混合液，混勻后加入8滴SDS60℃水浴保溫10min，此步的目的是使DNA與蛋白質(zhì)分離。(4)DNA溶解：稍冷加入5MNaCl溶液2ml，攪拌10min。

(5)蛋白質(zhì)沉淀：加等體積的氯仿—異戊醇，震蕩20min，4000rpm離心10min，離心杯中出現(xiàn)三層，上層為含DNA和殘留的DNA核蛋白的水層，中層為變性蛋白質(zhì)凝膠，下層是氯仿—異戊醇的有機(jī)相層。

(6)DNA析出：吸出上層的水相，慢慢加入95%冷乙醇，用玻璃棒攪出絲狀的DNA，晾干即為DNA實(shí)驗(yàn)產(chǎn)品。5、教學(xué)方式學(xué)生為主，教師輔助，充分預(yù)習(xí)，獨(dú)立完成。6、考核要求

同上基本考核要求。7、實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求

同上實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求

實(shí)驗(yàn)五紫外吸收法測定核酸含量

1、本次實(shí)驗(yàn)的目的和要求

學(xué)習(xí)紫外分光光度法測定核酸含量的原理和操作方法，熟悉紫外分光光度計(jì)的基本原理和使用方法2、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容或原理

DNA和RNA都具有紫外吸收的性質(zhì)，它們的紫外吸收高峰在260nm處。其紫外吸收特性是由于它們含有的嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)的共軛雙鍵系統(tǒng)的特性所決定的。每毫升溶液含1μgDNA鈉鹽的光吸收值為0.020，因此在260nm處測的未知樣的光吸收值即可求出其含量。

3、需用的儀器和試劑

試管、紫外分光光度計(jì)、水浴鍋晾干的DNA粗制品，蒸餾水4、實(shí)驗(yàn)步驟

（1）用蓋玻片刮取1mgDNA粗制品，溶于10倍體積的蒸餾水中。

(2)在260nm波長下，以蒸餾水作參照，在紫外分光光度計(jì)上測定其吸收值。5、教學(xué)方式

學(xué)生為主，教師輔助，充分預(yù)習(xí)，獨(dú)立完成。6、考核要求

考核要求同上。7、實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求

實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求同上。

實(shí)驗(yàn)六應(yīng)用紙層析法鑒定酶促轉(zhuǎn)氨基作用

1、本次實(shí)驗(yàn)的目的和要求

轉(zhuǎn)氨基作用是動(dòng)植物界普遍存在的一種生化反應(yīng)，研究動(dòng)植物體的轉(zhuǎn)氨基作用可以了解動(dòng)植物體不同發(fā)育階段代謝動(dòng)態(tài)的一個(gè)側(cè)面，從而研究控制其代謝途徑。2、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容或原理

由轉(zhuǎn)氨酶催化，經(jīng)轉(zhuǎn)氨基后，原來氨基酸上的氨基轉(zhuǎn)移到酮酸的相應(yīng)位置上，形成新的另外一個(gè)氨基酸和酮酸，可在濾紙上進(jìn)行層析并被茚三酮溶液檢出。3、需用的儀器和試劑

勻漿器、培養(yǎng)皿、試管、毛細(xì)血管、吹風(fēng)機(jī)、

0.01mil/L磷酸緩沖液，丙氨酸，α-酮戊二酸，飽和苯酚4、實(shí)驗(yàn)步驟

（1）肌肉靡的制作：取新鮮魚肉糜100g，加入100ml0.01mol/L磷酸緩沖液(pH7.4)，用勻漿器制成勻漿備用。

（2）酶促反應(yīng)：管號(hào)試劑0.1mol/L丙氨酸(ml)0.1mol/Lα-酮戊二酸(ml)肌肉靡(ml)1.01.02.01.01.02.0對(duì)照管測定管對(duì)照管加入肌肉靡后立即煮沸10min，而后放入37℃水浴中保溫30min，測定管37℃保溫30min后，立即于沸水浴中加熱10min終止反應(yīng)。冷卻后將二管分別過濾2滴到載玻片上待用。

（3）．點(diǎn)樣：取層析紙一張，找出圓心。通過圓心作垂直線，在2條垂直線上于圓心相

丙0．5cm測谷對(duì)照距0.5cm處，分別作為測定管和對(duì)照管及標(biāo)準(zhǔn)丙氨酸，谷氨酸的點(diǎn)樣位置如圖所示。點(diǎn)樣時(shí)將毛細(xì)管口輕輕點(diǎn)在濾紙上，使斑點(diǎn)直徑3mm，重復(fù)三次，每次待完全干燥后再點(diǎn)下一次。

（4）展層：點(diǎn)樣前在層析紙的圓心處打一小洞，取一小層析紙條，剪成刷狀，卷成燈芯狀，插入小孔內(nèi)，使毛刷朝下，點(diǎn)樣面朝上平放在盛有飽和苯酚的培養(yǎng)皿中，上面蓋上合適的培養(yǎng)皿。大約45min待溶劑前沿達(dá)到培養(yǎng)皿邊緣小于1cm處，取出層析紙，記下溶劑前沿去掉紙芯用吹風(fēng)機(jī)吹干層析紙。

（5）顯色：用噴霧器向?qū)游黾埦鶆驀姙?.1%茚三酮溶液，吹風(fēng)機(jī)吹干，層析紙上可看到紫色的斑點(diǎn)，比較色斑的位置及色的深淺記錄點(diǎn)樣點(diǎn)到色斑的距離及到點(diǎn)樣點(diǎn)到溶劑前沿的距離。

（6）計(jì)算每個(gè)樣點(diǎn)的Rf值

Rf=點(diǎn)樣點(diǎn)到色斑的距離/點(diǎn)樣點(diǎn)到溶劑前沿的距離5、教學(xué)方式

學(xué)生為主，教師輔助，充分預(yù)習(xí)，獨(dú)立完成。6、考核要求

同上基本考核要求。7、實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求

要求同上

六、實(shí)驗(yàn)教材及主要參考資料

劉祥云，張?jiān)瀑F，李天俊主編，《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》，201*年李建武等主編，《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法》，1994年趙永芳主編，《生物化學(xué)技術(shù)原理及應(yīng)用》，201*年

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