細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)總結(jié)

細(xì)胞自主實(shí)驗(yàn)方法總結(jié)

自主實(shí)驗(yàn)是在老師的指導(dǎo)和幫助下學(xué)生自己設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)且自己準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)所需的一切準(zhǔn)備工作來(lái)完成的實(shí)驗(yàn)。平時(shí)做實(shí)驗(yàn)老師占重要地位但自主實(shí)驗(yàn)中學(xué)生占重要地位。自主實(shí)驗(yàn)中學(xué)生自己思考設(shè)計(jì)出實(shí)驗(yàn)方案，實(shí)驗(yàn)所需試劑，實(shí)驗(yàn)方法和步驟然后按該方案來(lái)做實(shí)驗(yàn)。

老師讓學(xué)生做自主實(shí)驗(yàn)的原因是老師想培養(yǎng)學(xué)生的動(dòng)手能力，合作能力，想讓學(xué)生獨(dú)立思考，想讓學(xué)生親自動(dòng)手做實(shí)驗(yàn)，最重要的一點(diǎn)是把理論知識(shí)結(jié)合實(shí)踐。

細(xì)胞培養(yǎng)是在體外模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，培養(yǎng)從機(jī)體中取出的細(xì)胞，并使之生存和生長(zhǎng)的技術(shù)為細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。

本實(shí)驗(yàn)采用了微量全血培養(yǎng)技術(shù)，培養(yǎng)人體外周血小淋巴細(xì)胞,使原處于G0期的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞,進(jìn)而進(jìn)行有絲分裂，增殖成功率高、技術(shù)方法完善。把體外增殖的小淋巴細(xì)胞裂解,對(duì)細(xì)胞核染色體進(jìn)行染色和固定,制得人染色體標(biāo)本,用于進(jìn)行染色體組型分析，取得了令人滿意的效果。

人和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是動(dòng)物細(xì)胞工程的一項(xiàng)基本技術(shù)。目前,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)主要用于通過(guò)大量的細(xì)胞培養(yǎng)獲得有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的生物產(chǎn)品和細(xì)胞本身。1966年以前基本上用Moorhead等，1960年建立的人外周血白細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),該方法比較完善,成功率高。但缺點(diǎn)是取血量多,手續(xù)較麻煩。近30多年來(lái)國(guó)內(nèi)外絕大多數(shù)均采用微量全血培養(yǎng)技術(shù),不但取血量少,而且可略去一些繁瑣操作過(guò)程,如離心、分離血漿等,做起來(lái)既方便,也節(jié)省人力和物力,比較適于推廣和使用。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)操作要求比較高。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，無(wú)菌室及無(wú)菌操作臺(tái)以紫外燈照射30-60分鐘滅菌，以70%酒精擦拭無(wú)菌操作抬面，并開啟無(wú)菌操作臺(tái)風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)10分鐘后，才開始實(shí)驗(yàn)操作。實(shí)驗(yàn)完畢后，將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺(tái)，以70%酒精擦拭無(wú)菌操作抬面。操作間隔應(yīng)讓無(wú)菌操作臺(tái)運(yùn)轉(zhuǎn)10分鐘以上后，再進(jìn)行下一個(gè)細(xì)胞株之操作。操作做成中也要保證不污染。

擴(kuò)展閱讀：細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法總結(jié)

第三章

細(xì)胞生物學(xué)研究方法

METHODSANDTECHNIQUES第二版和第三版P49

從整個(gè)生命科學(xué)的發(fā)展趨勢(shì)看細(xì)胞生物學(xué)研究分子水平細(xì)胞水平結(jié)構(gòu)功能細(xì)胞生命活動(dòng)分析綜合

整個(gè)生命科學(xué)的發(fā)展最終是要解釋生命的活動(dòng)規(guī)律，而生命的活動(dòng)規(guī)律要到細(xì)胞中去尋找。而要了解細(xì)胞的活動(dòng)規(guī)律，我們要在分子水平細(xì)胞內(nèi)各種生物分子的代謝規(guī)律，這就需要研究細(xì)胞內(nèi)的各種組分

另外我們還要了解細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，2

由于課時(shí)所限，我們不可能所有的方法都詳細(xì)講解。3

Mainpoint

第一節(jié)顯微技術(shù)(細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察技術(shù)）一、光學(xué)顯微鏡二、電子顯微鏡三、顯微操作技術(shù)第二節(jié)細(xì)胞分離技術(shù)

第三節(jié)生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)第四節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞雜交本章重點(diǎn)：

1.掌握細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法（主要是光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡）；2.掌握細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程的基本技術(shù)；3.了解細(xì)胞組分的分析方法。第一節(jié)顯微技術(shù)

工具是人類器官的延伸。顯微鏡300多年的改進(jìn)是從器具和觀察對(duì)象兩方面著手提高放大倍數(shù)和增加分辨細(xì)微結(jié)構(gòu)的能力。

在器具上，包括選擇投射于物體上的波束的性質(zhì)及為便于觀察而不斷改善操縱裝置；在觀察對(duì)象上，則是如何突顯待觀察的部分。波束有光波和電磁波，

光學(xué)顯微鏡：以可見光（或紫外線）為光源。電子顯微鏡：以電子束為光源。第一節(jié)顯微技術(shù)

、光學(xué)顯微鏡(TheLightMicroscopy)（一）普通光學(xué)顯微鏡駱駝刺根尖染色體

對(duì)二氯苯飽和溶液處理9

光學(xué)顯微鏡是如何作到這一點(diǎn)的?（一）普通光學(xué)顯微鏡可變光闌管鏡目鏡

2.原理：經(jīng)物鏡形成倒立實(shí)像，經(jīng)目鏡進(jìn)一步放大成像。放大率（magnification）:最終成像的大小與原物體大小的比值;分辨率/力（Resolution）：分辨或區(qū)分兩質(zhì)點(diǎn)間最小距離。（一）普通光學(xué)顯微鏡

3.分辨力：指分辨物體最小間隔的能力。D=0.61λ/Nsinθ

其中λ為入射光線波長(zhǎng)；N=介質(zhì)折射率；

Nsinθ＝鏡口率(低倍鏡0.28，高倍鏡0.65，油鏡1.25.

2θ=鏡口角(樣品對(duì)物鏡鏡口的張角);

通常2θ最大值可達(dá)140度，空氣N＝1，D約0.3um。

油鏡N＝1.5，此時(shí)分辨率D可達(dá)0.2um，思考：如何提高顯微鏡的分辨能力？12

表一、幾種介質(zhì)的折射率（二）相差顯微鏡

Figure3-2.Interferencebetweenlightwaves.Whentwolightwavescombineinphase,theamplitudeoftheresultantwaveislargerandthebrightnessisincreased.Twolightwavesthatareoutofphasepartiallycanceleachotherandproduceawavewhoseamplitude,andthereforebrightness,isdecreased.A+/B+

相位板（annularphaseplate）在物鏡中加了涂有氟化鎂，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。分為兩種：

1.A+相板：將直射光推遲1/4λ，兩組光波合軸后光波相加，振幅加大，標(biāo)本結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加變亮，形成亮反差（或稱負(fù)反差）。

2.B+相板：將衍射光推遲1/4λ，兩組光線合軸后光波相減，振幅變小，形成暗反差（或稱正反差），結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加變暗。（二）相差顯微鏡基本原理：

利用光的衍射和干涉現(xiàn)象，把光程差變成振幅差(即明暗)。從而提高各種結(jié)構(gòu)間的對(duì)比度，明者更明，暗者更暗，立體感增強(qiáng)，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。故樣品不需染色，適合觀察活細(xì)胞。（二）相差顯微鏡

與普通光學(xué)顯微鏡相比有兩個(gè)特殊之處：相位板

環(huán)形光闌（位于光源與聚光器之間，作用是使透過(guò)聚光器的光線形成空心光錐，焦聚到標(biāo)本上。

使用時(shí)，環(huán)狀光闌的中心與物鏡光軸要完全在一直線上環(huán)狀光闌是由大小不同的環(huán)狀孔形成的光闌，它們的直徑和孔寬是與不同的物鏡相匹配的。其作用是將直射光所形成的像從一些衍射旁像中分出來(lái)。

用途：可觀察未經(jīng)染色的玻片標(biāo)本，活細(xì)胞動(dòng)態(tài)，有時(shí)也可用于觀察缺少反差的染色樣品。（三）微分干涉差顯微鏡（DIC）

原理：利用兩組平面偏振光的干涉。光線經(jīng)棱鏡折射后分成兩束，分裂出來(lái)的光束的振動(dòng)方向相互垂直且強(qiáng)度相等，光束分別在距離很近的兩點(diǎn)上通過(guò)被檢物體，在相位上略有差別。由于兩光束的裂距極小，而不出現(xiàn)重影現(xiàn)象，使圖象呈現(xiàn)出立體的三維感覺(jué)。20

平面偏振光光是一種電磁波,光振動(dòng)的方向與它前進(jìn)的方向垂直�；�礎(chǔ)知識(shí)

樣品經(jīng)過(guò)微分干涉差顯微鏡,厚度上的微小差異就轉(zhuǎn)化成明暗區(qū)別，增加反差，加強(qiáng)影像的明暗效果。

標(biāo)本可略厚一點(diǎn)，折射率差別更大，故影像的立體感更強(qiáng)。

用途：微分干涉差顯微鏡用于研究活細(xì)胞中較大的細(xì)胞器，與錄像設(shè)備結(jié)合，可觀察活細(xì)胞中的顆粒及細(xì)胞器的運(yùn)動(dòng)。DIC顯微鏡下的硅藻(偽彩色)

(A)普通明視場(chǎng)顯微鏡下的纖維原細(xì)胞(B)相差顯微鏡下的纖維原細(xì)胞,(C)微分干涉顯微鏡下的纖維原細(xì)胞(D)普通暗視場(chǎng)顯微鏡下的纖維原細(xì)胞.23

微分干涉差顯微鏡原生動(dòng)物[阿米巴變形蟲的顯微照片。進(jìn)行人工上色的三維圖像展示了豐富的細(xì)節(jié)。細(xì)胞中有些物質(zhì)，如葉綠體等，受紫外線照射后可發(fā)熒光；另有一些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒光，但如果用熒光染料（酸性品紅、啶橙，中性紅、甲基綠）或熒光抗體染色后，經(jīng)紫外線照射亦可發(fā)熒光，熒光顯微鏡不僅對(duì)這類物質(zhì)可進(jìn)行定性、定量和定位研究，還可觀察其形狀及在細(xì)胞內(nèi)的變化。

（四）熒光顯微鏡Fluorescencemicroscope

Fluorescenceimageofepithelialcell,DNAinblueandMicrotubulesingreen微管呈綠色、微絲紅色、核藍(lán)色

還可進(jìn)行免疫熒光觀察、基因定位、疾病診斷。圖像清晰，色彩逼真。

（四）熒光顯微鏡Fluorescencemicroscope特點(diǎn)：

1.光源為紫外線，波長(zhǎng)較短，分辨力高于普通顯微鏡；2.有兩個(gè)特殊的濾光片；3.照明方式通常為落射式。27

熒光顯微鏡是在光鏡水平對(duì)特異蛋白質(zhì)等生物大分子定性定位的最有力的工具。免疫熒光技術(shù)

熒光素直接標(biāo)記技術(shù)

GFP基因與某種蛋白基因融合，可直接觀察該蛋白的動(dòng)態(tài)變化。28

第一套濾光片為激發(fā)光濾片，裝在光源和樣品之間，只有能激發(fā)熒光染料發(fā)光的特定波長(zhǎng)才能通過(guò)。

第二套為阻斷濾片，裝在物鏡和目鏡之間，只讓染料所發(fā)出的熒光通過(guò)。這樣，在黑暗背景襯托下，很容易觀測(cè)到發(fā)出熒光的樣品。beam-splittingmirror（半透射反射鏡）：傾斜的、透明的鏡子，使光垂直地反射到觀察者的眼中。

Figure3-8.Fluorescentdyes.Thestructuresoffluoresceinandtetramethylrhodamine,twodyesthatarecommonlyusedforfluorescencemicroscopy.Fluoresceinemitsgreenlight,whereastherhodaminedyeemitsredlight.熒光素羅丹明

（五）激光共聚焦掃描顯微境

Laserconfocalscanningmicroscope,LCSM

原理：一束光線通過(guò)聚焦成點(diǎn)，在樣品表面掃描后成象。因?yàn)樵谝粋�(gè)時(shí)間試樣上只有一個(gè)點(diǎn)被照亮。隨著試樣被掃描，像素的積累便構(gòu)成了圖像。系統(tǒng)經(jīng)一次調(diào)焦，掃描限制在樣品的一個(gè)平面內(nèi)。調(diào)焦深度不一樣時(shí)，就可以獲得樣品不同深度層次的圖像，這些分層圖像再由計(jì)算機(jī)重構(gòu)成三維圖像。LCSM的原理：物鏡成像透鏡

共焦點(diǎn)是指物鏡和聚光鏡同時(shí)聚焦到同一小點(diǎn)。它在某一瞬間只用一束通過(guò)檢測(cè)器前的小孔的光成像，可顯著提高分辨率。可以觀察較厚樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

樣品制備無(wú)特殊要求；各種染色、非染色、熒光標(biāo)記的組織（包括活組織）、培養(yǎng)細(xì)胞、粘附細(xì)胞、細(xì)胞涂片、石蠟切片、冰凍切片。激光共聚焦掃描顯微境特點(diǎn)與用途：特點(diǎn)：

用激光作光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描。分辨力是普通光學(xué)顯微鏡的3倍。用途：

亞細(xì)胞定位及動(dòng)態(tài)變化。

能掃描不同層次，重構(gòu)出樣品的三維結(jié)構(gòu)（立體圖像）�？筛淖冇^察的焦平面，因而能進(jìn)行“光學(xué)切片”，觀察較厚樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。爪蟾黑色素細(xì)胞LCSM照片，藍(lán)色為細(xì)胞核，綠色為微管

共聚焦顯微鏡由于可以自動(dòng)改變觀察的焦平面，因此縱向分辨率得到改善。分辨率越高，意味著可使用的點(diǎn)數(shù)越多，圖像越細(xì)致。

受精5天后的卵子，一些精細(xì)胞仍粘貼在它表面。胚胎和精細(xì)胞核呈紫色，而精子的尾巴是綠色。藍(lán)色區(qū)域是縫隙連接，它們把細(xì)胞彼此聯(lián)系在一起。果蠅原腸胚表層細(xì)胞質(zhì)內(nèi)免疫熒光標(biāo)記的微絲A.免疫熒光技術(shù)B.LCSM36

GFP標(biāo)記的鼠神經(jīng)中樞干細(xì)胞移入剛出生的小老鼠的腦內(nèi)，已經(jīng)開始形成少突細(xì)胞和星細(xì)胞�！�

Figure3-3.Edgeeffects.Theinterferenceeffectsobservedathighmagnificationwhenlightpassestheedgesofasolidobjectplacedbetweenthelightsourceandtheobserver.（六）暗視野顯微鏡darkfieldmicroscope38

光學(xué)上的丁達(dá)爾現(xiàn)象（六）暗視野顯微鏡darkfieldmicroscope聚光鏡中央有擋光片，照明光線不直接進(jìn)入物鏡，只允許被標(biāo)本反射和衍射的光線進(jìn)入物鏡，因而視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。

應(yīng)用：觀察未經(jīng)染色4~200nm的活體或膠體粒子。（核、線粒體），分辨率比普通顯微鏡高50倍。

(a)梅毒螺旋體，暗視野。

(b)團(tuán)藻屬和水棉屬的綠藻；暗視野。

(c)迂回螺菌具有束狀鞭毛的一種個(gè)體很大的細(xì)菌。相差。(d)肉毒梭菌，它具有近端生卵形內(nèi)生孢子；相差。

(e)草履蟲染色后觀察到的中央大核和在其邊上的球形小核；相差。abcde

（七）倒置顯微鏡inversemicroscope

物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，物鏡在載物臺(tái)之下，照明系統(tǒng)在載物臺(tái)之上，用于觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)用于研究生物大分子之間的距離和相互作用。

傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用的研究方法都要破碎細(xì)胞或?qū)��?xì)胞造成損傷，無(wú)法做到在活細(xì)胞生理?xiàng)l件下實(shí)時(shí)的對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用進(jìn)行動(dòng)態(tài)研究。熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)技術(shù)的應(yīng)用結(jié)合基因工程等技術(shù)正好彌補(bǔ)了這一缺陷，該技術(shù)可用于研究活細(xì)胞生理?xiàng)l件下研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用。

（八）熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（fluorescenceresonanceenergytransfer，F(xiàn)RET）43

（八）熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（fluorescenceresonanceenergytransfer，F(xiàn)RET）

以GFP的兩個(gè)突變體CFP、YFP為例簡(jiǎn)要說(shuō)明其原理：

CFP的發(fā)射光譜與YFP的吸收光譜有相當(dāng)?shù)闹丿B，當(dāng)它們足夠接近時(shí)(10nm范圍內(nèi))，用CFP的吸光激發(fā)，其發(fā)色基團(tuán)將會(huì)把能量高效率地共振轉(zhuǎn)移至YFP的發(fā)色基團(tuán)上，所以CFP的發(fā)射熒光將減弱或消失，主要發(fā)射將是YFP的熒光。兩個(gè)發(fā)色基團(tuán)之間的能量轉(zhuǎn)換效率與它們之間的空間距離的6次方成反比，對(duì)空間位置的改變非常靈敏。

熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)就是采用非放射方法，在供體和受體相互靠得很近（bYFPaaexemexem

蛋白質(zhì)a與b之間的相互作用46

例如要研究?jī)煞N蛋白質(zhì)a和b間的相互作用，可以根據(jù)FRET原理構(gòu)建融合蛋白，這種融合蛋白由三部分組成：CFP、蛋白質(zhì)b、YFP。用CFP吸收波長(zhǎng)433nm作為激發(fā)波長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)靈巧設(shè)計(jì)，使當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)a與b沒(méi)有發(fā)生相互作用時(shí)，CFP與YFP相距很遠(yuǎn)不能發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，因而檢測(cè)到的是CFP的發(fā)射波長(zhǎng)為476nm的熒光；但當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)a與b發(fā)生相互作用時(shí)，由于蛋白質(zhì)b受蛋白質(zhì)a作用而發(fā)生構(gòu)象變化，使CFP與YFP充分靠近發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，此時(shí)檢測(cè)到的就是YFP的發(fā)射波長(zhǎng)為527nm的熒光。將編碼這種融合蛋白的基因通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)使其在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，這樣就可以在活細(xì)胞生理?xiàng)l件下研究蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用。

（九）熒光漂白恢復(fù)技術(shù)（FRAP）用途：主要檢測(cè)活體細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)部的分子運(yùn)動(dòng)以及在各種結(jié)構(gòu)上分子動(dòng)態(tài)變化率的大小。

原理：將大分子物質(zhì)（如蛋白質(zhì)或脂質(zhì)）耦聯(lián)上親脂性或者親水性的熒光分子（如熒光素或綠色熒光蛋白），采用高能量激光束照射特定的區(qū)域，是該區(qū)域熒光發(fā)生不可逆淬滅，但由于分子運(yùn)動(dòng)，其它區(qū)域攜帶熒光的生物大分子會(huì)移向淬滅區(qū)，從而恢復(fù)熒光漂白�；謴�(fù)的時(shí)間與運(yùn)動(dòng)速度有關(guān)。當(dāng)代顯微鏡的發(fā)展趨勢(shì)

采用組合方式，集普通光鏡加相差、熒光、暗視野、DIC、攝影裝置于一體。自動(dòng)化與電子化。光鏡標(biāo)本的制備以石蠟切片為例：

材料處理固定脫水包埋切片染色觀察

染色劑：普通染色劑，熒光染色劑二、電子顯微鏡

（一）透射電子顯微鏡（二）掃描電子顯微鏡1.原理

電子束的波長(zhǎng)短，并且波長(zhǎng)與加速電壓(通常50~120KV)的平方根成反比。52

掃描電鏡：20世紀(jì)60年代問(wèn)世，用來(lái)觀察標(biāo)本表面結(jié)構(gòu)。分辨力為5~10nm。

有效放大倍率為0.2mm/10nm=201*0X

工作原理：是用一束極細(xì)的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級(jí)電子，次級(jí)電子的多少與樣品表面結(jié)構(gòu)有關(guān)，次級(jí)電子由探測(cè)器收集，信號(hào)經(jīng)放大用來(lái)調(diào)制熒光屏上電子束的強(qiáng)度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。表1、不同光線的波長(zhǎng)2.Resolution

肉眼：0.2mm；光學(xué)顯微鏡：0.2um；電子顯微鏡，0.2nm分辨力與分辨率并不等同。

2.電鏡的結(jié)構(gòu)：電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)。3.用途：用于觀察超微結(jié)構(gòu)(ultrastructure)，即小于0.2m、光學(xué)顯微鏡下無(wú)法看清的結(jié)構(gòu)，又稱亞顯微結(jié)構(gòu)。電子顯微鏡透射電子顯微鏡

TRANSMISSIONELECTRONMICROSCOPE，TEM

為了使標(biāo)本表面發(fā)射出次級(jí)電子，標(biāo)本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬膜，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級(jí)電子信號(hào)。Scanningelectronmicroscope（SEM）表2、電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的比較

光學(xué)顯微鏡電子顯微鏡發(fā)光源燈泡電子槍光源可見光、紫外電子束光透鏡玻璃透鏡電磁透鏡真空系統(tǒng)空氣真空成象色彩彩色單色樣品要求無(wú)需脫水需脫水成像原理利用樣品對(duì)光利用樣品對(duì)的吸收形成明電子的散射暗反差和顏色和透射形成變化

明暗反差2、電子顯微鏡用到的一些技術(shù)（1）超薄切片技術(shù)

電子束穿透力很弱，用于電鏡觀察的標(biāo)本須制成厚度僅40-~50nm的超薄切片，用超薄切片機(jī)（ultramicrotome）制作。

這就要求樣品具有一定的剛性和韌性，SpecimenPreparationforElectronMicroscopy

通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，丙酮逐級(jí)脫水。以熱膨脹或螺旋推進(jìn)的方式切片，厚度:40-50nm石蠟切片的厚度:3-10um;SectionsofLM:>5um;SectionsofTEM:復(fù)膜顯示出了標(biāo)本蝕刻面的形態(tài)，在電鏡下得到的影像即代表標(biāo)本中細(xì)胞斷裂面處的結(jié)構(gòu)。主要用來(lái)觀察胞質(zhì)中的細(xì)胞骨架纖維及其結(jié)合蛋白。培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)面的深度蝕刻電鏡照片，網(wǎng)格蛋白衣被

Figure3-22.Three-dimensionalreconstructionfromserialsections.Singlethinsectionssometimesgivemisleadingimpressions.Inthisexamplemostsectionsthroughacellcontainingabranchedmitochondrionwillappeartocontaintwoorthreeseparatemitochondria.Sections4and7,moreover,mightbeinterpretedasshowingamito-chondrionintheprocessofdividing.Thetruethree-dimensionalshape,however,canbereconstructedfromserialsections.（4）電鏡三維重構(gòu)技術(shù)研究生物大分子三維結(jié)構(gòu)：

通過(guò)電鏡技術(shù)，從不同側(cè)面，不同層次獲得生物大分子的照片，經(jīng)傅里葉轉(zhuǎn)化，展示生物大分子的三維結(jié)構(gòu)。

生物大分子三維結(jié)構(gòu)是當(dāng)今生命科學(xué)研究的核心課題之一。（5）低溫電鏡技術(shù)：

近幾年發(fā)展起來(lái)的，樣品不固定、不染色、不干燥，直接包埋在100nm的冰膜包埋，電鏡內(nèi)-160℃，用相位襯度成像。展示生物大分子及其復(fù)合物表面與內(nèi)部的空間結(jié)構(gòu)，具更高分辨率。艾滋病毒

（6）掃描電子顯微鏡SEM

電子“探針”掃描，激發(fā)樣品表面放出二次電子，探測(cè)器收集二次電子成象。為了使標(biāo)本表面發(fā)射出次級(jí)電子，標(biāo)本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬膜，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級(jí)電子信號(hào)。

次級(jí)電子的多少與樣品表面結(jié)構(gòu)有關(guān)，次級(jí)電子由探測(cè)器收集，信號(hào)經(jīng)放大用來(lái)調(diào)制熒光屏上電子束的強(qiáng)度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。CO2臨界點(diǎn)干燥法防止引起樣品變形的表面張力問(wèn)題。血管破裂，一個(gè)個(gè)紅血球細(xì)胞正在慢慢的從破裂的血管流出酵母第三章

細(xì)胞生物學(xué)研究方法

METHODSANDTECHNIQUES第二版和第三版P49肺氣泡肺癌細(xì)胞74

肺氣泡是血液交換氣體的地方。（三）掃描隧道顯微鏡

scanningtunnelingmicroscope，STM原理：量子力學(xué)的隧道效應(yīng)，當(dāng)針尖在不到一個(gè)納米的高度上掃描樣品時(shí)，此處電子云重疊，外加一低電壓（2mV~2V），針尖與樣品之間形成隧道電流。電流強(qiáng)度與針尖和樣品間的距離有函數(shù)關(guān)系，將掃描過(guò)程中電流的變化轉(zhuǎn)換為圖像，即可顯示出原子水平的凹凸形態(tài)。分辨率很高:橫向?yàn)?.1~0.2nm，縱向可達(dá)0.001nm。優(yōu)點(diǎn):三態(tài)（固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)）物質(zhì)均可進(jìn)行觀察。

STMimage,BenzenemoleculesaccumulateatstepedgesonCu掃描隧道顯微鏡不僅僅只用于觀察單個(gè)的原子，還可通過(guò)顯微鏡的尖端、一些精良的刻度尺和穩(wěn)定的手來(lái)操縱單個(gè)的原子，如挑選原子或?qū)⑺鼈儚囊贿呁频搅硪贿��！皰呙杷淼里@微鏡是一次一個(gè)人操縱原子的首個(gè)最好的工具�！蓖ㄟ^(guò)此辦法，成功將12個(gè)溴原子通過(guò)分子的自我組合排成一個(gè)圓圈。三、顯微操作技術(shù)

micromanipulationtechnique

在倒置顯微鏡下利用顯微操作儀進(jìn)行細(xì)胞或早期胚胎操作的一種方法。顯微操作儀是用以控制顯微注射針在顯微鏡視野內(nèi)移動(dòng)的機(jī)械裝置。

顯微操作技術(shù)包括細(xì)胞核移植、顯微注射、嵌合體技術(shù)、胚胎移植以及顯微切割等。

細(xì)胞核移植技術(shù)已有幾十年的歷史，Gordon等人（1962）對(duì)非洲爪蟾進(jìn)行核移植獲得成功。我國(guó)著名學(xué)者童第周等上個(gè)世紀(jì)70年代在魚類細(xì)胞核移植方面進(jìn)行了許多工作，并取得了豐碩成果。

Thetechniqueforthetakeapartandgatherupofcell,andmicroscopemanipulation

PreparationandreformofkaryoplastandcytoplastTransgenicanimalsandplantsTransgenicmice10weeks44gand29g

克隆技術(shù)不僅對(duì)胚胎學(xué)、發(fā)育遺傳學(xué)、醫(yī)學(xué)有重大意義，而且也有巨大的經(jīng)濟(jì)潛力。首先克隆技術(shù)可用于器官移植，造福人類；也可改良物種，給畜牧業(yè)帶來(lái)好處。另外，克隆技術(shù)與轉(zhuǎn)基因技術(shù)相結(jié)合，可大批量“復(fù)制”含有可產(chǎn)生藥物原料的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，從而使克隆技術(shù)更好地為人類服務(wù)。我國(guó)有關(guān)科學(xué)家提出應(yīng)明確禁止克隆技術(shù)應(yīng)用于人類，否則將產(chǎn)生一系列倫理學(xué)、法律學(xué)等的災(zāi)難性問(wèn)題。電子顯微鏡能否代替光學(xué)顯微鏡？電子顯微鏡用電子束代替了光束，大大提高了分辨率，電子顯微鏡相對(duì)光學(xué)顯微鏡是個(gè)飛躍。但是

電子顯微鏡：1.樣品制備更加復(fù)雜；2.鏡筒需要真空，成本更高；3.只能觀察“死”的樣品，不能觀察活細(xì)胞。光學(xué)顯微鏡：1.技術(shù)性能要求不高，使用容易；2.可以觀察活細(xì)胞，觀察視野范圍廣，可在組織內(nèi)觀察細(xì)胞間的聯(lián)系；3.而且一些新發(fā)展起來(lái)的光學(xué)顯微鏡能夠觀察特殊的細(xì)胞或細(xì)胞結(jié)構(gòu)組分。因此，電子顯微鏡不能完全代替光學(xué)顯微鏡。第二節(jié)細(xì)胞分離技術(shù)

Figure3-31.Afluorescence-activatedcellsorter.當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過(guò)激光束時(shí)，根據(jù)細(xì)胞是否帶有熒光，包含有單個(gè)細(xì)胞的液滴被帶上正或負(fù)電荷。接下來(lái)這個(gè)液滴在電場(chǎng)作用下被收集到試管中。

注意：細(xì)胞的濃度必須調(diào)整到絕大多數(shù)液滴都不包含多個(gè)細(xì)胞，多個(gè)細(xì)胞的液滴不帶電荷而流入廢液杯中。流式細(xì)胞儀一、細(xì)胞的分離

二、細(xì)胞組分分離技術(shù)

1.Thetechniqueofdifferentialcentrifugation

Step-by-stepprocedureforthepurificationoforganellesbydifferentialcentrifugation.S=(dx/dt)/2x=110-13sec.密度

Figure3-34.Thepreparativeultracentrifuge.

轉(zhuǎn)速為1~2.5萬(wàn)rpm的離心機(jī)稱為高速離心機(jī)。

轉(zhuǎn)速>2.5萬(wàn)rpm，離心力>8.9萬(wàn)ｇ，稱為超速離心機(jī)。

目前超速離心機(jī)的最高轉(zhuǎn)速可達(dá)100000r/min，離心力超過(guò)500000g。（一）差速離心Differentialcentrifugation特點(diǎn)：

介質(zhì)密度均一；

速度由低向高，逐級(jí)離心。

用途：分離大小相差懸殊的細(xì)胞和細(xì)胞器。沉降順序：核葉綠體線粒體溶酶體與過(guò)氧化物酶體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體核蛋白體。

可將細(xì)胞器初步分離，常需進(jìn)一步通過(guò)密度梯離心再行分離純化。

Figure3-36.Comparisonofmethodsofvelocitysedimentationandequilibriumsedimentation.（二）密度梯度離心

A.速度沉降velocitysedimentationB.等密度沉降isopycnicsedimentation

用途：分離密度相近而大小不等的細(xì)胞或細(xì)胞器。特點(diǎn)：介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分離生物顆粒的最小密度。

原理：介質(zhì)密度梯度平緩，分離物按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達(dá)到分離。用途：分離密度不等的顆粒。

特點(diǎn)：介質(zhì)密度較高，陡度大，介質(zhì)的最高密度應(yīng)大于被分離組分的最大密度。所需的力場(chǎng)通常比速率沉降法大10~100倍，往往需要高速或超速離心。原理：樣品各成分在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的離心則沉降到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達(dá)到平衡，從而將不同密度的成分分離。

Figure3-37.Theseparationofsmallmoleculesbypaperchromatography.樣品點(diǎn)到層析慮紙的一端并且吹干，包含兩個(gè)以上試劑的液滴可通過(guò)毛細(xì)管作用緩慢移動(dòng)。樣品中的不同組分移動(dòng)速率不同。

2.Paperchromatography紙層析法又稱紙色譜法88

將紙取出，待溶劑揮發(fā)后，用顯色劑或其他適宜方法確定斑點(diǎn)位置。

Figure3-38.Theseparationofmoleculesbycolumnchromatography.層析柱有玻璃和塑料柱兩種，內(nèi)填有可滲透的固體基質(zhì)，如纖維素，而且基質(zhì)也被溶劑浸潤(rùn)。樣品放在柱子的最上端，然后大量的溶劑從上端緩慢流過(guò)柱子，樣品中不同的成分的遷移率不同，從而被分開，從柱子下端流入不同的試管。3.Columnchromatography

Figure3-39.Threetypesofmatricesusedforchromatography.離子交換柱(A)是一種帶有電荷的基質(zhì)，它可保留帶有相反電荷的分子，常用來(lái)分離蛋白質(zhì)，通常所用基質(zhì)為DEAE-cellulose,帶正電；CM-celluloseandphosphocellulose,帶負(fù)電。凝膠過(guò)濾柱(B)的基質(zhì)是惰性而多空的。比較小的分子因滲透到基質(zhì)中而移動(dòng)緩慢，較大的分子則從基質(zhì)分子的空隙中較快的分離出來(lái)。親和層析柱(C)的基質(zhì)分子上連接有一個(gè)特殊的配體，如抗體或酶基團(tuán)，這些基團(tuán)可以與特殊的分子結(jié)合，然后在洗脫下來(lái)。

Figure3-41.Thedetergentsodiumdodecylsulfate(SDS)andthereducingagentbeta-mercaptoethanol.ThesetwochemicalsareusedtosolubilizeproteinsforSDSpolyacrylamide-gelelectrophoresis.TheSDSisshownhereinitsionizedform.4.SDSpolyacrylamide-gelelectrophoresis

Figure3-42.SDSpolyacrylamide-gelelectrophoresis(SDS-PAGE).Electrophoresis

Figure3-44.Separationofproteinmoleculesbyisoelectricfocusing.AtlowpHthecarboxylicacidgroupsofproteinstendtobeuncharged(-COOH)andtheirnitrogen-containingbasicgroupsfullycharged(-NH3+),givingmostproteinsanetpositivecharge.AthighpHthecarboxylicacidgroupsarenegativelycharged(-COO-)andthebasicgroupstendtobeuncharged(-NH2),givingmostproteinsanetnegativecharge.AtitsisoelectricpHaproteinhasnonetchargesincethepositiveandnegativechargesbalance.Thus,whenatubecontainingafixedpHgradientissubjectedtoastrongelectricfieldintheappropriatedirection,eachproteinspeciespresentwillmigrateuntilitformsasharpbandatitsisoelectricpH,asshown.等電點(diǎn)聚焦電泳

Figure3-45.Two-dimensionalpolyacrylamide-gelelectrophoresis.AlltheproteinsinanE.colibacterialcellareseparatedinthisgel,inwhicheachspotcorrespondstoadifferentpolypeptidechain.Notethatdifferentproteinsarepresentinverydifferentamounts.Thebacteriawerefedwithamixtureofradioisotope-labeledaminoacidsandtheresultwasdetectedbyauto-radiography.(CourtesyofPatrickO"Farrell.)第三節(jié)、生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)一、細(xì)胞化學(xué)技術(shù)

組織化學(xué)或細(xì)胞化學(xué)染色：是利用染色劑可同細(xì)胞的某種成分發(fā)生反應(yīng)而著色的原理，對(duì)某種成分進(jìn)行定性或定位研究的技術(shù)。

利用這種方法對(duì)細(xì)胞的各種成分幾乎都能顯示，包括無(wú)機(jī)物、醛、蛋白質(zhì)、糖類、脂類、核酸、酶等。

二、細(xì)胞組分的顯示方法DNA的顯示方法:

1.甲基綠和毗羅紅兩種染色劑對(duì)DNA和RNA的親和力不同，甲基綠使DNA呈現(xiàn)綠色，毗羅紅使RNA呈現(xiàn)紅色。

2.Schiff反應(yīng)：Schiff試劑即亞硫酸品紅溶液，HO3S-C-(-C6H5-NH2)3，與細(xì)胞中的醛基（DNA或多糖）反應(yīng)呈現(xiàn)紅色。96

甲基綠和毗羅紅兩種染色劑對(duì)DNA和RNA的親和力不同，甲基綠使DNA呈現(xiàn)綠色，毗羅紅使RNA呈現(xiàn)紅色。利用甲基綠、毗羅紅混合染色劑將細(xì)胞染色，可以顯示DNA和RNA在細(xì)胞中的分布。鹽酸能夠改變細(xì)胞膜的通透性，加速染色劑進(jìn)人細(xì)胞，同時(shí)使染色體中的DNA與蛋白質(zhì)分離，有利于DNA與染色劑結(jié)合。

DNA分子結(jié)構(gòu)中帶有醛基-CHO,用HCl水解可使醛基釋放,再以無(wú)色的亞硫酸品紅液(Schiff)染色使醛基與亞硫酸品紅結(jié)合,呈現(xiàn)紫紅色,這是DNA特有的顯色反品紅溶液通入二氧化硫得到的無(wú)色物質(zhì),又名希夫（Schiff）試劑,遇醛顯紅色,遇酮不變色,可以區(qū)別醛和酮這是分子HO3S-C-(-C6H5-NH2)RNA被酸水解后降解。97

二、細(xì)胞組分的顯示方法蛋白質(zhì)的顯示方法：

用于蛋白質(zhì)的定性和定位。

1.米倫(Millon)反應(yīng)→顯示酪氨酸的方法蛋白質(zhì)上酪氨酸+氮汞試劑→紅色沉淀2.重氮反應(yīng)

[原理]芳香伯胺與亞硝酸作用,在酸性，低溫下(<5℃)可生成重氮鹽，即四氮鹽。在堿性條件下，四氮鹽與組氨酸,色氨酸及酪氨酸的苯環(huán)結(jié)合產(chǎn)生偶聯(lián)反應(yīng)形成有色復(fù)合物。98

四氮化聯(lián)鄰茴香胺法(Tetra-azotized-o-anisidine)[應(yīng)用]廣泛應(yīng)用于顯示酶的活性

[原理]芳香伯胺與亞硝酸作用,在低溫下(<5℃)可生成重氮鹽,此即重氮反應(yīng).重氮鹽可與酚類作用生成有色化合物偶氮化合物.上述反應(yīng)必須在酸性條件下進(jìn)行.本實(shí)驗(yàn),聯(lián)鄰茴香胺在酸性,低溫條件下與亞硝酸作用生成四氮鹽.四氮鹽有兩個(gè)重氮鹽,其中一個(gè)重氮基在堿性條件下與所要顯示的組氨酸,色氨酸及酪氨酸的苯環(huán)結(jié)合產(chǎn)生偶聯(lián)反應(yīng),另一個(gè)重氮基與酚類或奈類發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)以增色.因此,可以用生成的偶氮染料來(lái)代表組織細(xì)胞的蛋白質(zhì)含量.二、細(xì)胞組分的顯示方法多糖的顯示方法：

高碘酸雪夫法(PAS法)：

[原理]高碘酸為強(qiáng)氧化劑,它可以氧化多糖分子內(nèi)1,2乙二醇(順式和反式)而產(chǎn)生醛基,此醛基再與Schiff試劑結(jié)合即產(chǎn)生紅紫色。99

中性多糖糖原

碳水化合物酸性多糖硫酸軟骨素A,B,C,肝素,硫酸角(組織中多糖類)質(zhì)素,透明質(zhì)酸等

蛋白多糖粘蛋白,唾酸粘蛋白糖脂腦苷脂類

※組織中糖的種類較多,因此,要特異性地顯示各種糖類必須用抑制和酶水解來(lái)對(duì)照實(shí)驗(yàn).二、細(xì)胞組分的顯示方法細(xì)胞內(nèi)脂類染色：

用易溶于脂類的染料,使之溶于所檢的脂質(zhì)(如脂滴)中，使組織內(nèi)的脂類著色。如：四氧化鋨與不飽和脂肪酸反應(yīng)呈黑色，蘇丹Ⅲ與脂滴反應(yīng)呈深紅色。100

二、細(xì)胞組分的顯示方法細(xì)胞堿性磷酸酶：底物：甘油磷酸酯反應(yīng)產(chǎn)物：磷酸根再加入：鉛鹽或鈷鹽

產(chǎn)生：磷酸鉛或磷酸鈷無(wú)色沉淀再加入：硫化銨產(chǎn)生：有色沉淀1102

根據(jù)免疫學(xué)原理，利用抗體同特定抗原專一結(jié)合，對(duì)抗原進(jìn)行定位測(cè)定的技術(shù)。常用的標(biāo)記物有熒光素和酶。（二）植物細(xì)胞培養(yǎng)

外植體培養(yǎng)：誘發(fā)產(chǎn)生愈傷組織。用于研究植物的生長(zhǎng)發(fā)育、分化和變異；進(jìn)行無(wú)性繁殖；制取代謝產(chǎn)物。

懸浮細(xì)胞培養(yǎng)：適合于進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)，制取植物代謝產(chǎn)物。原生質(zhì)體培養(yǎng)：培養(yǎng)脫壁后的細(xì)胞，特點(diǎn)：①比較容易攝取外來(lái)的遺傳物質(zhì)，如DNA；②便于進(jìn)行細(xì)胞融合，形成雜交細(xì)胞；

③適宜條件下可產(chǎn)生細(xì)胞壁，經(jīng)誘導(dǎo)分化成完整植株。單倍體培養(yǎng)：通過(guò)花藥或花粉培養(yǎng)可獲得單倍體植株。二、細(xì)胞融合

同核體：相同基因型的細(xì)胞融合而成。異核體：不同基因型的細(xì)胞融合而成。

自發(fā)融合：同種細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中自發(fā)合并的現(xiàn)象。誘發(fā)融合：異種間的細(xì)胞必須經(jīng)誘導(dǎo)劑處理才能融合。

誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法：生物方法（仙臺(tái)病毒、副流感病毒和新城雞瘟病毒）、化學(xué)方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（電擊和激光）。單克隆抗體技術(shù)

正常淋巴細(xì)胞（如小鼠脾細(xì)胞）具有分泌抗體的能力，但不能長(zhǎng)期培養(yǎng)，瘤細(xì)胞（如骨髓瘤）可以在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)，但不分泌抗體。于是英國(guó)人Kohler和Milstein1975將兩種細(xì)胞雜交而創(chuàng)立了單克隆抗體技術(shù)，獲1984年諾貝爾獎(jiǎng)。單克隆抗體技術(shù)主要作用

用單克隆抗體代替多克隆抗體克服了交叉反應(yīng),提高了免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)的特異性和敏感性,從而促進(jìn)了醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)的發(fā)展;

用單克隆作親和柱,可分離提純含量極低的可溶性的抗原,如激素,細(xì)胞因子和難以純化的腫瘤抗原等，為物質(zhì)提純開辟了一條新途徑；

制備的單克隆抗體識(shí)別細(xì)胞表面特異性受體,若將抗腫瘤藥物(如毒素或放射性物質(zhì))偶連到其上,構(gòu)建生物導(dǎo)彈,有望攻克人類頑疾--腫瘤。

單克隆抗體有廣闊的發(fā)展前景,但有其局限性。單克隆抗體作為外源性的抗原，多次反復(fù)的注射后能促使機(jī)體發(fā)生免疫應(yīng)答,產(chǎn)生相應(yīng)的抗抗體,產(chǎn)生排斥現(xiàn)象，因此單克隆抗體應(yīng)用于臨床有其風(fēng)險(xiǎn)性，在緊急預(yù)防的情況下，可以慎用。

總之，單克隆抗體為人類在檢驗(yàn)疾病、治療疾病方面取得了重大突破,盡管它還有些弊端,相信在不久的將來(lái)人類會(huì)制備出更加優(yōu)良的單克隆抗體,為攻克腫瘤作出更大的貢獻(xiàn)!第四節(jié)模式生物模式生物的特點(diǎn)有:

1)生理特征能夠代表生物界的某一大類群；2)容易獲得并易于在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)繁殖；3)容易進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作,特別是遺傳學(xué)分析。1海膽

最早被使用的模式生物，主要用于早期發(fā)育生物學(xué)(受精，早期胚胎發(fā)育)。

1891年，HansDriesh在顯微鏡下把剛剛完成第一次卵裂的海膽胚胎一分為二，發(fā)現(xiàn)分開后的兩個(gè)細(xì)胞各自形成了一個(gè)完整幼蟲，證明了胚胎具有調(diào)整發(fā)育的能力。為現(xiàn)代發(fā)育生物學(xué)奠定了第一塊觀念里程碑。2病毒

基因組小，易于遺傳操作，可作為外源基因載體。3細(xì)菌大腸桿菌

培養(yǎng)簡(jiǎn)單易于操作，繁殖能力強(qiáng)，繁殖時(shí)間短等因素，常作為實(shí)驗(yàn)材料，在遺傳學(xué)中主要作為遺傳變異的物種，利用其變異來(lái)選取更好的材料，用在其他工業(yè)等方面如：發(fā)酵，菌體培養(yǎng)，醫(yī)療藥物的提取等。大腸桿菌的存在，使得試驗(yàn)易于操作。4酵母釀酒酵母

特點(diǎn):1)是單細(xì)胞生物,可在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng),可通過(guò)改變物理或化學(xué)環(huán)境完全控制其生長(zhǎng)2)在單倍體和二倍體的狀態(tài)下均可生長(zhǎng),并可在實(shí)驗(yàn)條件下控制單倍體和二倍體之間的相互轉(zhuǎn)換,這對(duì)其基因功能的研究十分有利

3)有將近31%編碼蛋白質(zhì)的基因或ORF與哺乳動(dòng)物編碼蛋白質(zhì)的基因有高度的同源性5線蟲

Caenorhabditiselegans特點(diǎn)：

1)通身透明，長(zhǎng)不過(guò)1mm。

2)身體中所有細(xì)胞能被逐個(gè)盤點(diǎn)并各歸其類。幼蟲：556個(gè)體細(xì)胞，2個(gè)原始生殖細(xì)胞。

成蟲：雌雄同體成蟲，959個(gè)體細(xì)胞，201*個(gè)生殖細(xì)胞。雄性成蟲(偶見)：1031個(gè)體細(xì)胞，1000個(gè)生殖細(xì)胞。

3)生命周期短，從生到死僅為三天半，使得不間斷地觀察并追蹤每個(gè)細(xì)胞的演變成為可能。

4)把線蟲浸泡到含有核酸的溶液中可實(shí)現(xiàn)基因?qū)�入�?果蠅

drosophilamelanogaster

主要用于遺傳和發(fā)育研究。

其特點(diǎn)為：繁殖迅速，染色體巨大，易于進(jìn)行基因定位。

由14個(gè)體節(jié)構(gòu)成的軀干完全對(duì)稱，一套基因控制了這些體節(jié)從上到下的發(fā)生過(guò)程，這套基因普遍存在于從昆蟲到人的基因組中，是決定機(jī)體左右對(duì)稱布局形成的最基本因素。7斑馬魚斑馬魚特點(diǎn):

1)產(chǎn)卵多，繁殖迅速。

2)胚胎通體透明，是進(jìn)行胚胎發(fā)育機(jī)理和基因組研究的好材料。8小鼠

17世紀(jì)開始用于解剖學(xué)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，經(jīng)長(zhǎng)期人工飼養(yǎng)選擇培育，已育成千余個(gè)獨(dú)立的遠(yuǎn)交群和近交系，是生物醫(yī)學(xué)研究中廣泛使用的模式生物，是當(dāng)今世界上研究最詳盡的哺乳類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。1999年，美英幾家大型科研機(jī)構(gòu)成立了老鼠基因組測(cè)序的合作團(tuán)體，201*年8月公布了老鼠基因組物理圖譜的框架，完整的老鼠基因組圖譜于201*年完成。模式生物小鼠的應(yīng)用

轉(zhuǎn)基因小鼠與基因剔除小鼠小鼠突變品系與人類疾病研究

帶有人生長(zhǎng)激素基因的轉(zhuǎn)基因小鼠（右側(cè)小鼠為轉(zhuǎn)基因小鼠，左側(cè)為正常小鼠）。130

小鼠生理生化和發(fā)育過(guò)程和人類相似性，基因組的高度同源性以及的基因組改造技術(shù)的成熟性，均說(shuō)明利用小鼠建立人類疾病的模型可以真實(shí)模擬人類疾病的發(fā)病過(guò)程及對(duì)藥物的反應(yīng)。因此，利用小鼠等模式動(dòng)物建立的人類疾病模型具有重大理論和運(yùn)用價(jià)值。8擬南芥－“植物中的果蠅”Arabidopsisthaliana

擬南芥的基因組是目前已知植物基因組中最小的。每個(gè)單倍染色體組（n=5）的總長(zhǎng)只有7000萬(wàn)個(gè)堿基對(duì)，即只有小麥染色體組長(zhǎng)的1/80，這就使克隆它的有關(guān)基因相對(duì)說(shuō)來(lái)比較容易。擬南芥是自花受粉植物，基因高度純合，用理化因素處理突變率很高，容易獲得各種代謝功能的缺陷型。131

擬南芥的優(yōu)點(diǎn)是植株小（1個(gè)茶杯可種植好幾棵）、每代時(shí)間短（從發(fā)芽到開花不超過(guò)6周）、結(jié)子多（每棵植物可產(chǎn)很多粒種子）、生活力強(qiáng)（用普通培養(yǎng)基就可作人工培養(yǎng)）。模式生物基因組計(jì)劃

模式生物基因組計(jì)劃是人類基因組計(jì)劃的一個(gè)重要組成部分，是人類基因組計(jì)劃的必要補(bǔ)充并對(duì)后者的研究有很大的促進(jìn)作用。

由于人類對(duì)自身理解的限制、實(shí)驗(yàn)的限制和倫理學(xué)的制約，醫(yī)學(xué)、生物學(xué)的研究在很大程度上依賴于對(duì)一些模式生物的研究。在研究人類基因組的同時(shí)，平行地進(jìn)行一些微生物、植物、動(dòng)物等模式生物基因組的研究，不僅可為人類基因組研究做方法學(xué)和組織工作的積累，而且通過(guò)將從模式生物中所得到的數(shù)據(jù)和資料與人類基因組進(jìn)行同源性比較，借以闡明人類相應(yīng)基因的功能。因此，一些與人類基因具有相似性，但結(jié)構(gòu)和基因組成都相對(duì)比較簡(jiǎn)單的生物體就成為進(jìn)行人類基因組研究的絕好樣本，即為人類基因組研究提供參照，對(duì)這些模式生物的基因組進(jìn)行測(cè)序和分析，就是模式生物基因組計(jì)劃。

四．請(qǐng)從下列20種方法（A-T）中，挑選一種最佳方法來(lái)探測(cè)下面的10個(gè)問(wèn)題

方法A，X射線衍射，B，SOUTHERN雜交，C，掃描電鏡技術(shù)，D，細(xì)胞顯微分光光度計(jì)E，免疫熒光技術(shù)，F(xiàn)，電鏡超薄切片技術(shù)，G，Northern雜交，H，放射自顯影技術(shù)I，核磁共振技術(shù)J，DNA序列分析，K，原位雜交技術(shù)L，Western雜交技術(shù)Ｍ，核酸電鏡及核酸異源雙鏈分析技術(shù)Ｎ，電鏡負(fù)染色技術(shù)Ｏ，細(xì)胞融合技術(shù)Ｐ，飽和雜交技術(shù)Q，免疫電鏡技術(shù)R，冷凍蝕刻復(fù)型技術(shù)S，顯微液相技術(shù)T，DNA定點(diǎn)突變技術(shù)

問(wèn)題1粗略估計(jì)某種組織的基因組大概有多少的DNA序列正在轉(zhuǎn)錄mRNA2某種抗癌藥物的作用機(jī)制是阻止腫瘤細(xì)胞的DNA復(fù)制還是阻止蛋白質(zhì)合成

3已克隆了雞卵清蛋白的基因，如何證明在雛雞的輸卵管中該基因不轉(zhuǎn)錄而在產(chǎn)卵母雞輸卵管中則活躍地轉(zhuǎn)錄

4已克隆了人的rDNA問(wèn)rDNA分布在人的哪幾條染色體上

5把分離的線粒體置于電場(chǎng)中，問(wèn)電場(chǎng)作用是否會(huì)使線粒體內(nèi)膜上蛋白質(zhì)分布發(fā)生改變6體外培養(yǎng)細(xì)胞，從G1期到S期，細(xì)胞表面形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化

7已提純了某種雙鏈DNA病毒的DNA分子，并克隆了這種病毒的一個(gè)基因，問(wèn)該基因病毒基因組的哪個(gè)部位上

8原代細(xì)胞長(zhǎng)成致密單層，由于接觸抑制作用DNA合成停止，如何證明9觀察腺病毒核衣殼表面的亞單位-衣粒形態(tài)與排列方式

10研究酵母菌在無(wú)氧和有氧條件下生長(zhǎng)時(shí)，其線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化

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